(1)问题的提出

①如果大鼠/小鼠证候是真实的，应该有其内在的物质基础。疾病大鼠/小鼠常见证候的物质基础是什么?②涉及哪些组织层面，换句话说，检测什么组织好?③在RNA转录层面上有什么变化?④采用什么技术手段能有效地检测其复杂的物质基础，以避免个别指标的以偏概全和大量信息的遗漏，如何入手?

(2)研究方法和结果

以往虚证本质的研究发现，神经-内分泌-免疫组织与证候的关系密切；中药药效学实验已观察到不同疾病的不同组织、基因表达存在广泛的改变，中药及其复方具有广泛的调节作用；以往的国内外研究一再证实，基因的转录数量总体上与蛋白的表达数量相关；而基因芯片技术的发展使基因转录检测技术成为分子生物学最为先进和发达的技术。我们早年的研究发现，不同证候荷瘤小鼠肿瘤、垂体等组织，一些基因的表达存在差异，与国内一些学者观察到的一些现象近似。这些为我们后续实验设计创造了前提。

在上海市科委国际合作项目和上海市教委重点学科建设经费的资助下。我们采用小鼠计量化四诊和辨证方法，以及先进的Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术，观察了早期邪毒壅盛、气虚，中期阳气虚和中晚期气阴阳虚等4个证候的H22荷瘤小鼠下丘脑、垂体、肾上腺、颌下腺(原计划检测甲状腺)、睾丸、胸腺、脾脏、肿瘤等8个神经-内分泌-免疫-肿瘤组织基因表达与剪接的特征。初步的研究发现：

1)荷瘤小鼠肿瘤发生的早期，下丘脑、垂体、肾上腺RNA转录模式发生显著改变，突出表现为RNA的18s和28s含量及其比值出现改变。下丘脑28s RNA迅速抬升并持续，气虚强于邪毒壅盛证；垂体却相反，28s陡降，邪毒壅盛证尤甚；肾上腺RNA电泳图谱特征类似垂体。

2)荷瘤小鼠不同证候不同组织的基因表达存在显著的差异。与正常对照小鼠相比，在芯片的16661个核心基因中：4个不同证候荷瘤小鼠下丘脑有1286个基因表达存在差异，垂体有510个，肾上腺有445个，颌下腺有848个，性腺有852个，脾脏有1023个，胸腺有1298个，4个不同证候荷瘤小鼠肿瘤有3713个基因表达存在差异。合计共有9975个基因表达发生差异(图1-3-24)!

3)荷瘤小鼠不同证候不同组织的基因外显子剪接存在显著的差异。与正常对照小鼠相比：4个不同证候荷瘤小鼠下丘脑有7109个外显子剪接存在差异，垂体有12006个，肾上腺有9861个，颌下腺有15109个，性腺有2355个，胸腺有5393个，脾脏有5539个。与邪毒壅盛证候相比：其余3个不同证候荷瘤小鼠肿瘤有8863个外显子剪接存在差异。合计共有66235个外显子剪接发生差异(图1-3-25)!我们进一步的研究发现，其中部分基因确有可能存在基因剪接的差异，并可能具有重要的病理意义。

4)一些组织差异表达基因的情况。由于芯片数据处理和后续研究尚未结束，部分结果表明：

①垂体层面。与正常小鼠相比，邪毒壅盛证和气虚证垂体表达上调的基因有5个，其中邪毒壅盛证Alas2、Sgk、Cbln3表达高，十分突出，可能与该证候形成有关；另外，邪毒壅盛证和气虚证垂体有13个基因表达几乎关闭!其中Abpg、Pip，以及Car6、Klklb22、Klk1b3、Klk1b9、Muc10、Rer1、Hspala、Wfdc12等在正常对照小鼠垂体表达量大，可能是垂体具有重要生理功能的基因，其关闭可能与肿瘤早期荷瘤小鼠处于应激状态有关，并导致其预后差。

②肾上腺层面。正常小鼠肾上腺高表达的基因主要参与代谢和基因表达的调控，部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导。肿瘤发生后，邪毒壅盛证独特上调的基因涉及信号转导与免疫应答的Pomcl、Tnfaip6、Ccr12、Rgs1等，调控转录的Bhlhb2、Ell2、Atf3、Hivep2、Klf4等，参与代谢调节的Usp37、Chka、 Dusp10等；邪毒壅盛证独特下调基因有Hbxip、H2-T22、Ndufs6，Tgfb1、 Mgat4b、Cdkl3等。气虚证独特上调基因有Pde10a、Olfr1305、Olfr46、Cyp3a13等；气虚证独特下调基因涉及激素类Gh、Pomc1、Prl、Cga和原癌基因Junb。气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠，反映出气虚证候的本质及在转录组学上的特征。

③睾丸层面。正常小鼠睾丸高表达的基因多数与激素合成、精子生成与功能有关。肿瘤发生的早期，邪毒壅盛证上调的基因有Abpg、Pip、Muc10、Car6、2310057J18Rik、Klk1b3、Klk1、Wfdc12(Swam2)等8个；下调的基因有Spcs1、Dtx3、Rasa3、Sec11l3、F5等5个。气虚证上调的基因有Gpx5、Wbp5、Lcn5、Ap1s2等4个；下调的基因有1个，Klk1b26。中期阳气虚证无上调基因，下调基因有3个，分别为Klk1b27、Spag5、Gpx5(在早期气虚证上调)；中晚期气阴阳虚证上调基因2个，分别为Saa3、S100a8，下调基因5个：Abpg、Pip、Muc10、Car6、 Cuzd1(前4个与邪毒壅盛证重复)。

④肿瘤层面。邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个，其中包括Tcte3、Phf7、Ldhc等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个，Adipoq、Nrcam、 Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个，以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个；邪毒壅盛证独特性低表达的基因2个，有Cort和LOC668417。同期气虚证独特性高表达的基因9个，其中包括H2-Eb2、H2-K1、H2-Ea和Sla等4个与TCR或BCR有关的基因，以及P2ry1、Cobral、Sprrla等5个其他功能类的基因；独特性低表达的基因19个，包括MMP8、MMP9、MMP10等3个MMPs家族基因，S100a8、S100a9等2个S100家族基因，Lcn2、Clec4d、Clec4e等5个细胞因子和黏附分子类基因，以及Slc6a9、4930402E16Rik、Ddit4等9个其他功能类的基因。

(3)结论

1)荷瘤小鼠常见证候是有复杂的物质基础的，这从另一角度证明荷瘤小鼠常见证候是客观存在的。

2)不同证候荷瘤小鼠在下丘脑、垂体、肾上腺、颌下腺、睾丸、胸腺、脾脏、肿瘤等多层面发生了特殊性的改变，涉及基因表达与剪接差异两个层面。

3)鉴于神经-内分泌组织基因表达具有周期性和节律的变化，以上部分基因表达的改变，可能与此有关，需要反复且多批次实验，甚至是专门的对照实验，才能予以准确刻画和界定与不同证候的关系。

4)该研究为揭示证候复杂的物质基础，揭示辨证论治的疗效机制等进行了有益的尝试。

最近，我们开展了自发性高血压大鼠、自发性糖尿病大鼠(重点在气虚证)，以及重复开展了荷瘤小鼠常见证候(重点在气虚证、邪毒壅盛证)的下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、睾丸、胸腺、脾脏、肿瘤、胰腺、肾脏等组织基因表达差异的实验研究。采用Affymetrix GeneChip ® Mouse Exon 1.0 ST Array和Affymetrix GeneChip® Rat Exon 1.0 ST Array等芯片和技术。部分RNA电泳图谱与两年前检测的图谱具有一致性。目前正着手芯片检测和数据处理工作。初步的结果提示，自发性高血压大鼠和自发性糖尿病大鼠，与荷瘤小鼠一样，其常见证候有其独特的不同层面的物质基础。