单细胞饲养层制备有两种方法 : 丝裂霉素处理法和γ射线法。一定剂量的丝裂霉素和 射线能够使细胞停止分裂 , 但又不至于马上死亡,在体外可维持一段时间生命。故可利用其处 理饲养层细胞使饲养层细胞不分裂,又能存活并分泌抑制 ES 细胞分化和促进 ES 细胞增值的因子,保证 ES 细胞的生长。
( 一 ) 丝裂霉素处理法
(1)MEFs 或 STO 细胞融合成单层,弃培养液,加入含10µg/ml 丝裂霉素 C 溶液(覆盖细胞单层即可),37 ℃、5%C02、100% 湿度培养箱内放置2～3h。
(2) 弃丝裂霉素处理液,用 PBS 充分洗涤3～5次,除去残余丝裂霉素C,因其能影响ES细胞的生长。
(3) 消化液消化制成 3 × 105 个/ml 浓度的细胞悬液,种植到预先用 0.1%明胶处理过的培养瓶或培养皿内(0.1% 明胶覆盖培养瓶或培养皿表面,室温放置 2h以上,用前吸弃多余的明胶,直接使用或稍干燥后使用 )。
(4)37℃、5%C02、100% 湿度培养箱培养,细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素处理过的细胞,这样制成的饲养单层可使用 6～1Od,用前更换ES细胞培养浓。
(5)MEFs 或 STO 细胞单层用丝裂霉素处理及 PBS 充分洗涤后,也可以不消化直接使用。
( 二 ) γ射线法
(1)MEFs 或 STO 细胞融合成单层后,用射线γ照射,剂量为30～100Gy。
(2) 余下的步骤同丝裂霉素处理法（3）～（5）。
(3) 照射过的细胞也可以 5 × 106 个 /ml 浓度冻存备用。