目前饲养细胞有两大类 : 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 和小鼠纤维母细胞 (STO) 及已稳定表达了LIF和 neor 的 STO 细胞(如 SNL 细胞)。
( 一 )MEFs 的制备和培养
(1) 性成熟雌小鼠(7～8周龄左右)与雄鼠 (8 周龄以上 )1:2 比例合笼,每天早上观察雌小鼠阴道口,有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕,见栓当天为怀孕 0.5d。
(2) 怀孕 12.5～14.5d 孕鼠,断颈处死,无菌条件下暴露子宫,镊住近子宫段,分离子宫系膜,剪断子宫角,提起整个子宫,在灭菌滤纸上吸干血迹,置入盛有 PBS 或无血清 DMEM平皿内。
(3) 沿子宫系膜侧剪开子宫,摘取胚胎,置入另一盛有 PBS 或无血清 DMEM 平皿内,充分洗涤,去除血迹。
(4) 用小镊子撕破胎膜,取出鼠胚,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干置入另一盛有 PBS或无血清 DMEM 平皿内,至少洗涤 3 次,完全去除红细胞。
(5) 用眼科小剪刀或刮胡子刀片将鼠胚躯干剪(切)成 1mm3 以下的碎块 , 吸至离心管内。
(6) 加入等体积膜蛋白酶 -EDTA 消化液,轻轻吹打 3Os 。
(7) 加入等体积MEFs培养液终止膜蛋白酶的消化作用,800～100Or/min 离心 5min，弃上清液。
(8) 加入 5ml 左右的 MEFs 培养液重新悬浮鼠胚组织,移入培养瓶内 (每 5个鼠胚可使用1个 100～150ml培养瓶)让组织悬浮液能均匀覆盖培养瓶表面(培养液不宜过多),培养箱培养条件是37 ℃、 5%C02 、100% 湿度。
(9) 培养开始2d不要晃动培养瓶,第 3 天组织附着培养瓶,表面细胞长出,补充培养液或更换培养液,继续培养。
(10) 第4～5天,细胞连成一片,即可消化制成细胞悬液,置离心管内静置5～10min,取上层液即为单细胞悬液,以 1:3 比例传代,一般采用3～5代作饲养细胞用。
(11) 也可将鼠胚躯干组织碎块收集离心管后重复下列操作 5～6 次:加入等体积消化被轻轻吹打3Os;加入等体积培养液终止消化,静止3～5min,收集上层单细胞悬液;最后弃大块组织,将收集到的单细胞悬液离心 800～1OOOr/min,弃上清,加入培养液,分装培养瓶皿,37 ℃、5%C02、100% 湿度培养。每天观察,及时更换培养液和传代,同样以 1:3 比例传代,用3-5 代作饲养细胞用。
( 二 )STO 细胞培养
STO 细胞是 SIM 小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系细胞,广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和 ES 细胞的饲养细胞。其代替 MEFs 的优点是:细胞易于生长及不需要经常准备怀孕母鼠,但 STO 细胞必须保持在最适生长条件下,否则易于变异。特别是生长密度过大时。目前已有稳定转染了 LIF 和 neor 的 STO 细胞株(如 SNL 细胞),可用于ES细胞的转染和筛选。STO 细胞的培养按一般细胞株的培养方法即可,培养液与 MEFs 相同。