孕前慢性应激后仔鼠学习记忆与胰岛素样生长因子Ⅱ表达相关性研究

内容

孕前慢性应激后仔鼠学习记忆与胰岛素样生长因子Ⅱ表达相关性研究

摘要 ：［目的］观察孕前慢性应激后仔鼠学习记忆能力与海马中胰岛素样生长因（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）的表达变化，探讨仔鼠学习记忆能力变化的机制。［方法］建立慢性应激孕前大鼠模型，通过血浆皮质酮动态测定来检测模型，采用Morris水迷宫和Y迷宫进行学习记忆能力测定、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-timepolymerase chain reaction，RT-PCR）检测海马中IGF-Ⅱ表达水平。［结果］模型组母鼠血浆皮质酮水平增高（P<0.05）；模型组所产仔鼠只数及母鼠孕天数均少于对照组（P<0.05），两组雌雄比例差异无统计学意义（P>0.05）；模型组仔鼠血浆皮质酮高于对照组仔鼠（P<0.05）；模型组仔鼠学习、记忆能力低于对照组（P<0.05）；模型组仔鼠IGF-ⅡmRNA表达量低于对照组仔鼠（P<0.05）。［结论］孕前慢性应激后仔鼠空间学习记忆能力下降，可能与其脑内IGF-Ⅱ表达的下调及体内皮质酮升高有关系。

关键词 ：孕前 ；应激 ；仔鼠 ；学习记忆 ；皮质酮 ；胰岛素样生长因子Ⅱ

流行病学证据表明 ：妊娠期的精神社会应激、紧张的活动可致孕妇皮质醇水平升高，是早产、低体质量儿等不良妊娠结局的独立危险因素，而且妊娠期应激与婴幼儿的睡眠、成长、学习成绩、情绪控制、注意力都有很大的关系，但其发生机制尚不明确。胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growthfactor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）又称生长调节素A，其在胚胎及中枢神经系统生长发育中起着关键作用。近年来，国内外关于孕前慢性应激对子代认知功能影响的研究逐渐增多，而 IGF-Ⅱ和孕前应激后子代的学习记忆能力之间的相关性未见研究，因此，本项目拟通过建立孕前慢性应激大鼠模型，观察应激后仔鼠学习记忆能力及海马中IGF-Ⅱ表达变化，探讨其学习记忆损伤的可能机制，为深入理解和预测应激的遗传性危害研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组　

未曾受孕的成年Wistar雌鼠20只，体质量250~280g，雄性大鼠10只，体质量300~350g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号 ：SCXK（新）2011-000。1.1.1 雄鼠分组 雄性大鼠10只，编号后，按随机数字表随机分为模型交配组（5只）和对照交配组（5只，合笼正常条件饲养，在此过程中只为交配，不接受任何应激）。

1.1.2 雌鼠分组 按随机数字随机平均分为两组，孕前慢性应激模型组（10只，以下简称“模型组”）和正常对照组（10只，以下简称“对照组”）。模型组每笼1只、对照组每笼5只饲养。

1.2 方法

1.2.1 孕前应激动物模型建立 参照WILLNER等设计的慢性应激动物模型建立方法加以改动。模型组给予每日1次，连续21d的随机应激刺激，包括 ：（1）31℃温水游泳1h ；（2）8~10℃冰水游泳5min ；（3）42℃烘箱热应激5 min ；（4）夹尾1 min ；（5）食物剥夺24h ；（6）水剥夺24h ；（7）60个不可回避的足底电击 ：0.5 mA电流强度，持续2 s，间隔1 s ；（8）拥挤（10只合笼）加上倾斜笼具（30度角）24 h ；（9）摇晃应激（160r/min，1h）。不同的应激随机实施，相同的应激7d内不连续使用。刺激（要求模型组和对照组两个饲养间的光照水平，温度基本一致），刺激完毕后送回原饲养间。

1.2.2 母鼠的受孕 应激模型建立及评估结束之后，模型交配组及对照交配组按1∶2 比例分别与模型组及对照组合笼。合笼后每天检查雌鼠阴道栓至明确妊娠后，将雌鼠与雄鼠分离，模型组雌鼠分笼（1只/笼）、对照组（5只/笼）均在正常环境下饲养。

1.2.3 仔鼠分组 模型组和对照组，均记录其存活幼仔的数目，称取每窝质量。孕鼠分娩的当天命名为PND 0（postnatal day 0，即出生后第0天），两组所处室温保持在（21±1）℃，湿度保持在（55±5）%。PND 21时断乳、雌雄分别编号、分笼饲养。PND42时，随机抽取各组仔鼠20只（雌雄各半）。

1.3 主要仪器设备与试剂

试剂 ：ReverttAid First Strand cDNA Synthesis Ki（tK1622，Thermo Scientific）；SYBR Select Master Mix（4472920，ABI）。仪器 ：梯度PCR仪（Bio-Rad，USA，MyCycler Thermal Cycler）；Real Time PCR instrumen（tABI，USA，7500）；Morris水迷宫视频跟踪分析系统、Y迷宫刺激器（上海欣软信息科技有限公司）；125I-皮质醇放射免疫测定盒（北京北方生物技术研究所）。

1. 4 观察指标及测定方法

1.4.1 母鼠和仔鼠血浆皮质酮水平测定　 两组母鼠在应激前1天，应激后第1、7、14、21天 ；仔鼠在PND 42，分别行内眦静脉取血2 mL，分别置于含枸橼酸钠的抗凝管内，离心分离出血浆，采用放射性免疫法测定血浆皮质醇的含量。检测结果中皮质酮含量由皮质醇测定值换算得来，换算公式 ：皮质酮浓度=皮质醇浓度×50（皮质酮是啮齿类动物主要的糖皮质激素，大鼠血浆皮质酮与皮质醇含量比恒定，约为50∶1）。

1.4.2 仔鼠学习记忆功能的测定 Morris水迷宫实验 ：训练共历时5d。平台位置在同一批大鼠训练及测试过程中保持不变。第1d先将大鼠抱上平台，20s后随机选择1个入水点将其面向桶壁放入水中使其有反身动作，记录并观察大鼠寻找平台所需时间（逃避潜伏期），取走平台，并记录120s内大鼠穿越该平台象限次数。“Y”型电迷宫实验 ：应用MG-3Y迷宫刺激器，测试成绩分为学习成绩和记忆成绩，学习成绩以大鼠达到连续9次以上正确反应时所需的电击总次数为准，记忆成绩以学习完后再电击10次中正确反应的次数（N /10）为准。

1.4.3 RT-PCR检测IGF-ⅡmRNA的表达 以1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，快速剥离大脑皮层，取出海马予液氮中快速冷冻，储存在-80℃，为 RT-PCR备用。总RNA的抽提，按照Trizol试剂使用说明书提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度，要求A260/A280在1.7~2.0，确定总RNA浓度后进行逆转录合成cDNA。从PUBMED/ Nucleotide GenBank中查出大鼠IGF-Ⅱ基因全序列，β-actin序列作为内参照，应用Primer Premier 5.0设计引物，引物由北京奥科生物公司合成。序列为 ：IGF-Ⅱ上游引物 5c-TACCTCTCAGGCCGTACTTCC-3c，下游引物5c-TCCAGGTGTCGAATTTG AAGA-3c。扩增产物长度为74bp。PCR反应条件为 ：50℃预变性2min，95℃变性2min，95℃退火15s，60℃延伸1min，共40个循环。PCR产物的半定量分析 ：扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，拍照，并用计算机凝胶成像系统提取图像，通过比较IGF-Ⅱ与β-actin 密度值，进行半定量分析。

1.5 统计学分析

全部数据录入Excel 2003，采用SPSS 17.0统计软件包对所有数据进行分析，计量资料均以x±s表示，两组间比较采用t检验，而对于不同时间点同一指标测量数据采用重复测量资料的方差分析，指标相关性分析采用积差相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组母鼠血浆皮质酮水平

重复测量资料方差分析后，模型组母鼠皮质酮与对照组比较，差异有统计学意义（F=14.996，P=0.001），时间因素有统计学意义（F=64.607，P<0.001），时间与应激因素之间存在交互关系（F=8.144，P=0.001）。每个时间点的比较 ：在应激前及应激后第1天，模型组分别与对照组血浆皮质酮比较，差异均无统计学意义（P>0.05），模型组在给予慢性应激第7天高于对照组（P<0.05），且达高峰，提示模型组大鼠处于应激状态，见表1。

2.2 两组母鼠所产仔鼠基本情况

模型组所产仔鼠只数及孕天数与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），模型组仔鼠只数、孕天数少于对照组（P<0.05）；两组雌雄比例差异无统计学意义，见表2。

2.3 两组仔鼠血浆皮质酮水平

在 PND 42 时，模 型 组 仔 鼠 血 浆 皮 质 酮 为（199.23±34.55）ng/mL，高于对照组的（182.38±27.66）ng/mL，差异有统计学意义（t=1.703，P<0.05）。

2.4 两组仔鼠学习记忆功能

重复测量资料方差分析发现，模型组子代在水迷宫中逃避潜伏期与对照组子代比较，差异具有统计学意义（F=7.578，P<0.001），时间因素差异有统计学意义（F=64.682，P < 0.001），时间与应激因素之间不存在交互关系（F=1.444，P=0.228），结合数据得出 ：模型组子代逃避潜伏期时间比对照组子代长，且有随时间缩短的趋势 ；多个时间点，两组逃避潜伏期间差异有统计学意义，且模型组子代潜伏期长于对照组子代。t 检验分析 ：两组跨平台次数间差异有统计学意义（t=2.264，P=0.001），模型组子代次数低于对照组子代，见表3。

模型组子代在Y迷宫试验中学习、记忆能力与对照组子代比较，差异具有统计学意义（P<0.05），模型组子代学习、记忆能力低于对照组子代，见表4。

2.5 两组仔鼠海马IGF-ⅡmRNA表达水平

模型组仔鼠IGF-ⅡmRNA表达量为（0.55±0.28），低于对照组的（1.08±0.25），差异有统计学意义（t=3.451，P<0.05）。

2.6 相关分析

水迷宫中逃避潜伏期和Y迷宫中学习能力与母鼠、仔鼠血浆皮质酮存在正相关性（P<0.05），与IGF-ⅡmRNA 均呈负相关性（P<0.05）；水迷宫中跨平台次数和Y迷宫中记忆能力与母鼠、仔鼠血浆皮质酮存在正相关性（P<0.05），与IGF-ⅡmRNA 均呈正相关性（P<0.05），见表5。

3 讨论

当有害刺激作用于机体时，便可刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPAA）的兴奋，导致血中皮质醇浓度升高，而高浓度的皮质醇又可引起情绪行为的改变，从而进一步增加心理应激效应。在应激的实验研究中，很多都以皮质醇浓度显著升高作为产生应激的条件。本实验结果显示，模型组母鼠血浆皮质酮的水平高于对照组，表明大鼠产生了应激，孕前应激动物模型成立，但是有下降的趋势，其机制可能是随着应激时间的延长，肾上腺功能逐渐由兴奋转向适应。有研究显示，Wistar大鼠窝平均活胎数12~14只，而本次实验模型组所产仔鼠只数及孕天数远低于对照组，这也是应激影响到母鼠妊娠能力所致早产和少产结果的体现，原因在于孕前应激时，胎儿暴露于过高的糖皮质激素环境下，对仔代HPA轴的功能进行了重新编程而引起，与以往动物实验结果一致。该实验还发现，模型组仔鼠血浆皮质酮高于对照组，可见孕前慢性应激母鼠所产仔鼠的应激水平要高于不处于应激状态下所产仔鼠，处于高应激反应期。原因在于皮质酮可通过胎盘屏障进入仔代血液中，导致孕前慢性应激，仔鼠皮质酮水平增高，而GRIFFIN等也发现孕前应激可致胎龄19 d的仔鼠血清皮质酮升高。

学习记忆是人和动物在复杂环境中生存所必需的生理功能，是大脑高级而复杂的神经生理活动。尽管有人认为轻度的母体应激会增强子代的空间学习和记忆能力，但多数研究认为，母体慢性应激会损害子代的空间学习、记忆能力。流行病学及动物实验研究发现，母体接受慢性不可预见性应激（chronic unpredictable stress，CUS）将对子代大脑发育产生不良的影响，儿童精神分裂症、抑郁症、焦虑症、注意力缺陷多动障碍、记忆障碍、学习困难等心理行为性疾病的发生与母亲妊娠前、妊娠期间和分娩后的CUS都存在程度不等的联系。本研究通过Morris水迷宫和Y迷宫试验检测小鼠的空间学习记忆能力，结果发现，在定位航行试验和工作记忆中，模型组仔鼠的逃避潜伏期显著增长，而跨平台次数少于对照组，且模型组仔鼠在Y迷宫试验中学习、记忆能力均低于对照组 ；说明孕前慢性应激对仔鼠的学习记忆能力确实有影响。

IGF-Ⅱ是一类广谱生长因子，也是目前发现的功能最为复杂的生长因子，它对于个体的生长发育起着重要的作用，虽然在刺激机体生长的作用弱于IGF-Ⅰ，但是在成人体内起主导作用的胰岛素样生长因子是IGF-Ⅱ。IGF-Ⅱ是神经营养因子家族中的重要成员，与细胞增殖、分化、程序性死亡和转化有着密切联系，在个体的生长、发育中起着重要的作用，是迄今发现的生物学功能最为复杂的生长因子。2011年，CHEN等在Nature中描述到，IGF-Ⅱ具有巩固记忆和防止遗忘的生物学作用，能够促进细胞的增殖、分化，减少细胞的程序性死亡。本研究显示，模型组仔鼠的IGF-ⅡmRNA表达量与对照组比较，差异具有统计学意义，模型组仔鼠IGF-ⅡmRNA表达量低于对照组。原因在于海马IGF-Ⅱ发挥学习记忆功能需要学习记忆信号转导通道中增强子结合蛋白β（C/EBPβ）的协助，而C/EBPβ则是记忆巩固中必不可少的因子，IGF-Ⅱ含量降低，C/EBPβ也会下降，功能降低，致使学习记忆能力下降。这也可为今后由于多种原因导致学习记忆损伤的干预提供一定的思路。而有研究报道，在应激加强训练后的大鼠脑内海马区注射IGF-Ⅱ，能够帮助大鼠学习记忆能力的恢复。

综上所述，孕前慢性应激后仔鼠胚胎期发育减慢，血浆皮质酮升高，且空间学习记忆能力下降，同时，海马中IGF-Ⅱ的表达也显著降低。相关性分析结果共同说明孕前受慢性应激后子代学习记忆能力下降可能与其脑内IGF-Ⅱ表达的上调及体内皮质酮升高有关系。