一、实验目的

脊髓全横断损伤(SCT)是中枢神经系统的一种严重创伤，由于损伤后脊髓缺乏自身修复能力，脊髓功能的损害呈不可逆性改变，患者受伤后大多终身丧失劳动力，生活不能自理，造成沉重的家庭和社会负担。

SCT常常是在原发性损伤局部血管的破坏出血、水肿及神经元的破坏等基础上，原发性水肿的扩展、组织细胞缺血缺氧导致的微循环和能量代谢的改变等多因素共同作用，使原病灶周围原先完整的组织继续遭受破坏。最终造成脊髓的不可逆性损伤。原发损伤与继发损伤形成髓鞘残片、少突胶质细胞、少突胶质细胞碎片残留和损伤所致的反应性胶质瘢痕及脊髓空洞共存的微环境，该环境能抑制轴突生长，阻碍神经再生。目前脊髓损伤治疗研究主要集中在以下方面：①控制继发性损伤的进展，包括手术减压、激素冲击疗法、亚低温治疗、钙通道阻断、兴奋性氨基酸拮抗、自由基清除等。②促进轴突再生、修复受损的髓鞘，加强中枢神经的可塑性并促进未损伤区域的代偿功能。包括细胞移植、神经生长因子的应用。③解除或中和脊髓损伤后抑制轴突再生的各种因素，包括应用抗轴突生长抑制因子、应用基因沉默等技术间接促进轴突的再生。移植载体方面的研究主要集中在胚胎脊髓组织、神经干细胞、外周神经、施万细胞及基因修饰的功能细胞等。SCT的发病机制十分复杂，且脊髓损伤的修复不同于其他组织的修复，不仅要求对神经组织进行位置和形态上的修复，而且要求功能上的替代和修复，目前仍没有一种药物能从根本上解决SCT后的解剖重建和功能恢复等难题。故以期通过探究脊髓损伤、修复的分子机制，从根源上找到治疗SCT的方法。

由于小鼠在生理、某些行为、代谢等方面具有与人类相似的特点，故成为生命科学和医药研究理想的动物模型。下文将介绍小鼠脊髓全横断损伤模型的建立及神经功能损伤的评价方法。

二、实验材料与方法

(一)实验材料

其包括高温干燥箱、制冰机、全自动消毒锅、普通冰箱、低温冰箱、电子天平。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.实验动物与分组  本实验动物选用雌性C57BL/6J健康小鼠(昆明医科大学实验动物中心提供)，体重(25±5)g，7月龄。随机分为两组：SCT与假手术组。每组动物10只。动物自由饮食，室温22～25℃。

2.小鼠脊髓全横断损伤模型的制备及术后护理

(1)术前准备及麻醉：检查小鼠的健康状况，称重，编号。右下腹剃毛消毒，于腹股沟中点上方0.5cm进针，3.6％水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉。麻醉过程中注意保温，助手详细记录每只小鼠的手术开始及结束时间，以及估计失血量，以便术后治疗、护理。

(2)模型的制备：用3.6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(1ml/100g)，俯卧位固定，常规备皮，消毒铺巾，以T8、T9为中心，取一背部正中切口，长1～1.5cm，逐层分离筋膜、肌肉，暴露 T8～T10(第6～8胸椎)节段脊椎棘突，钝性分离T8～T10节段脊椎椎骨上的肌肉，咬骨钳咬除 T8～T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。在T10处用眼科镊将脊髓提起，再用眼科剪在T10脊髓节段水平横断脊髓，并用眼科镊从断口提出，以确保脊髓已完全横断，缝合伤口。

(3)术后护理：术后将动物分笼饲养，自然光照、通风；并勤换清洁、干燥的饲养笼垫料，始终保持干燥；被尿液浸湿的肢体及时用温肥皂水清洗，并用电吹风吹干；加强营养，喂食鸡蛋、葵花籽，将饲料、饮水置于动物可及范围；严密观察动物精神状态、饮食、排尿、排便、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统血性分泌物等情况，并给予人工排尿，每日3次；腹腔注射青霉素10万U/次，每日2次；预防自残；预防肠梗阻。

3.BBB评分方法  采用Basso等提出的BBB评分体系评分，总分21分，考查小鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置，表示脊髓损伤和治疗后小鼠后肢运动功能恢复的过程。该评分简单直观，易于掌握，与脊髓恢复有极好的一致性。实验动物分别在术后7d、14d、21d、28d评定。观察前排空膀胱，以免影响小鼠活动，而后将动物置于平坦不滑的实验台上，观察4min，对动物的躯体定位及后肢功能进行行为学评分。评分者为熟悉评分标准的非本组实验人员，由3人评分后取平均值。观察时间根据小鼠的活动习性定在20：00左右。评价依据见表2-1。

4.实验操作中的注意事项

(1)小鼠体积较小，对于手术损伤等操作耐受性差，术后极易死亡，因此，加强术后护理，注意保暖，及时人工排尿，防止泌尿系统感染，加强营养，对于提高术后小鼠存活率十分重要。要求术后分笼喂养，定期通风，勤换清洁、干燥的饲养笼垫料，始终保持干燥；被尿液浸湿的肢体及时用温肥皂水清洗，并用电吹风吹干。

(2)小鼠脊髓全横断术，椎管操作手术视野狭窄，操作困难，术中要注意小心避开大血管，尽量进行钝性分离，减少术中出血，术中注意保暖，小心操作，术后密切关注，及时补液。

(3)小鼠脊髓全横断后，下半身运动、感觉消失，可能出现自残行为，咬伤尾、后肢等部位，引起出血、感染，甚至导致死亡，因此，术后可用薄塑料片制成颈套，缺口处用胶布粘贴，防止自残。

三、实验结果

1.本实验建立两组损伤模型  SCT组和假手术组。小鼠在术后2～3h完全清醒，SCT组所有小鼠均表现为完全截瘫，后肢及尾无活动，损伤平面以下肌张力降低，对针刺无反应。说明SCT造模成功。假手术组小鼠于术后24h开始逐步恢复后肢及尾部活动。

2.全横断后小鼠后肢功能BBB评分  手术前两组小鼠评分均为21分，造模后，各实验组小鼠后肢运动功能评分均随时间的延长逐渐增高。术后第1周，各组小鼠无后肢运动，或有一个关节轻微运动，SCT组与假手术组相比，横断组的运动功能障碍明显(P=0.000，P<0.05)，说明全横断造模成功。术后第2周，假手术组后肢运动功能已经完全恢复，并且保持稳定。

四、结果分析

目前已建立了多种脊髓损伤模型。但仍很难获得一种接近于人类脊髓损伤的理想模型。在众多的脊髓损伤模型中，脊髓全横断模型是一种较为稳定、可靠的模型，它为科学、真实地评价完全性脊髓损伤后的神经再生提供了保障。实验性动物损伤模型能模拟实际临床急性脊髓全横断情况。

一般情况下，颈髓和胸髓显示相同的恢复率，胸腰髓损伤恢复率较低。这说明不同部位再生能力是不同的。本文选择胸腰髓交界处的T10节段制作模型，为进一步研究脊髓损伤这一医学难题奠定了基础。BBB评分法为0～21级的较为精细详尽的方法，但在实际使用过程中发现，此方法易于主观评分，导致结果不准确，故实验由3人独立观察记录，评估均在单盲情况下进行。晚上为鼠类生活习性活跃的时段，因此每次评分均在晚上8：00左右进行。

本实验在脊髓横断1周后BBB评分即可达4分，后肢3个关节(髋、膝、踝)均有轻度活动。