实验性变态反应性脑脊髓炎动物的症状、病理改变及免疫学特征与人类的脱髓鞘疾病如：多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)、急性播散性脑脊髓炎相似，常被看作是这类疾病的动物模型。Rivers等于1933年采用多次肌肉注射兔脑提取物的方法，首次成功建立了变态反应脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)模型。随后 Morgan和Kabat又把福氏佐剂(Freund adjuvant, FA)引入到EAE的建立过程中，即把抗原与福氏佐剂混合制成乳剂，单次免疫即可成功诱发EAE。这不但简化了EAE的建立过程，而且极大地提高了模型的可靠性。为研究MS的发病机制、治疗和预防复发创造了有利的条件。

EAE动物模型制备

1.动物选择  由于不同品种动物或同一品种不同品系动物存在着不同的遗传背景，表现为免疫系统的T细胞克隆株对自身抗原的反应性不同。因此，在选择动物时需要寻找EAE模型的敏感动物，如SJL/J、B10PL、PL/J小鼠，Lewis大鼠、豚鼠及家兔等都是良好的EAE敏感动物。

(1)抗原和抗原乳剂的制备和免疫途径  常用的致敏抗原有髓鞘碱性蛋白(MBP)、脂蛋白(PLP)或其多肽片段(如MBP peptide 89-101)，髓鞘素(myelin)、脑脊髓组织匀浆(brain spinal cordhomogenous, BSCH)也可作为致敏抗原。抗原的提取方法可参考文献。提取的抗原需和福氏完全佐剂(FCA)制成抗原乳剂后用于致敏动物。不同实验室所选致敏用抗原及佐剂中分支结核菌蛋白浓度有所差别，但它对动物发病率至关重要。MBP抗原和结核菌素常用量为每只小鼠50～1000μg。

免疫抗原和佐剂剂量在一定范围内随浓度增高使动物发病率增加，于FCA中加入百日咳杆菌[每只大鼠(1×100000)～(1×1000000)个]可明显提高EAE的发病程度，可使EAE敏感性弱的Wistar大鼠变得敏感。抗原佐剂为非特异性免疫增强剂，它可改变抗原的物理性状，增加抗原在体内的储留时间，刺激抗原提呈细胞、淋巴细胞，从而增强和扩大免疫应答效果。动物一般经l次皮下或脚垫注射抗原后9～11d即开始发病，反应严重的动物可死亡，未死亡者一般在注射抗原后3周开始逐渐恢复。

(2)动物发病程度的判定标准  通常根据Knono等提出的标准，分为5级。1级：动物尾部无力；2级：尾部无力加肢体无力；3级：肢体轻度麻痹；4级：肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原；5级：濒死状态。

(3)抗原特异性T细胞增殖试验  分离提取发病动物淋巴结细胞与MBP共育培养于96孔细胞培养板。细胞培养孔5组，每组4孔，每孔培养液200μl中细胞数为2×10000个。各组细胞分别含5mg/L MBP、50mg/L PPD、50mg/L OVA、1×10000U/L IL-2，和培养基(MA)对照。于5％ CO2、37℃孵育，72h后收集细胞，收集前6h每孔加入18.5×10的-10次方μBq 3H-TdR，液闪仪测Bq值。

(4)T淋巴细胞分离和T细胞CD表型分析  取(1×100000)～(1×1000000)个细胞，用抗CD3、CD4、CD8单抗荧光染色，荧光激活细胞分类器分析阳性细胞百分比。

(5)脑脊髓组织病理和免疫组化分析  常规方法应用含4％多聚甲醛PBS液灌流动物心脏后，取脑和脊髓做冷冻切片，HE染色，观察病变部位和细胞浸润及细胞CD分子表型。

2.EAE被动转移试验  分离EAE抗原特异反应性T细胞转输给同一品系健康动物致健康动物发病，这是研究 EAE发病机制的最直接证据，它也是研究EAE的治疗预防措施的良好模型。EAE抗原特异性CD4T细胞转移模型的制备方法包括下列步骤。

(1)淋巴细胞培养及CD4细胞筛选  取发病动物淋巴结进行细胞培养。应用24孔培养板，每孔4×1000000个细胞，于115ml 10％(体积分数)FCS RPMI 1640培养基中同时加入50mg/L MBP，于5％CO2孵箱中培养6～7d。收集细胞，Ficoll分离单个核细胞，再次与MBP共育培养，并于细胞孔中加入同品系小鼠脾细胞(预先去除红细胞，并经按2.9×10的10次方Bq/kg体重剂量的放射线照射)作为饲养细胞，继续培养到21d。

(2)特异性反应测定  测定细胞对抗原的特异性反应。    (3)PKH2-GL标记细胞  用HBSS稀释调整细胞浓度为2×10的10次方/L，和等量PKH2-GL稀释液配制的PKH2- GL荧光溶液(1ml稀释液含PKH2-GL原液8μl)混合，在室温下静置作用5min，然后分别先用5％FCS HBSS、HBSS各洗3次，计数后动物尾静脉注射每只1×10000000个细胞，之后约10d观察EAE症状。

(4)脑和脊髓中单个核细胞分离  动物按350～400mg/kg体重的剂量经腹腔注射水合氯醛麻醉麻醉后，用 PBS(60～100ml)心脏充分灌流，摘取脑和脊髓于10％FCS RPMI 1640中剪切成约0.5～1.0mm小块，用10ml吸管吸取组织悬液，边磨边吹通过尼龙网漏斗，离心沉淀组织悬液，弃上清，沉渣混悬于70％Percoll液中，并分配到离心管下部、上部分别放置于70％和35％的Percoll液，离心吸取70％和35％Percoll界面细胞，即为单个核细胞层。

(5)细胞表型分析  取(1×100000)～(1×1000000)个细胞，经流式细胞仪分析CD4阳性细胞、PKH2-GL标记细胞和细胞激活状况。发病后分离脑组织淋巴细胞FACS则可见到 PKH2-GL标记细胞，而肝脾组织中极少发现PKH2-GL阳性细胞，表明具有器官特异性。

从鸟类到哺乳类的多种动物如鸡、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可诱发EAE。但动物品系不同，其敏感性有很大的不同，对EAE敏感的动物有Lewis、DA大鼠，PL/ J、SJL/J小鼠以及Hart/ley、Strain 13豚鼠等。且鼠的EAE无论在临床表现、病理还是免疫、生化改变等方面都与人类脱髓鞘疾病较为相似，因此，目前大鼠及小鼠的应用最为广泛。国内研究者用Wistar大鼠也成功地复制了EAE模型。下面以大鼠为例具体介绍一种EAE的复制。

大鼠变态反应性脑脊髓炎动物模型(Model of allergic encephalomyelitis in rats)

(1)复制方法  Wistar大鼠，体重为200～220g。新鲜牛脊髓60g(也可取新鲜羊脑白质200g)，去除筋膜和血管，剪碎，加入适量预冷的氯仿；甲醇(2：1)溶液，高速组织分散器匀浆后加氯仿；甲醇(2：1)溶液至620ml，4℃冰箱电动搅拌12h，用布氏漏斗加滤纸抽滤，在未完全抽干前加310ml氯仿；甲醇(2：1)溶液电动搅拌2h，抽滤，如此抽滤2次。沉渣加310ml -20℃预冷丙酮搅拌2h，抽滤2次。沉渣加入620ml双蒸馏水中，电动搅拌12h，抽滤两次，沉渣溶于100ml双蒸馏水中，0.5mol/L HCl调pH至3.0，冰箱中搅拌1h，4℃1500r/min，离心60min，取上清液置透析袋中过夜。以考马斯亮蓝法测定髓鞘碱性蛋白(MBP)含量为3.2g/L，用真空冷冻干燥机将MBP的粗提品干燥，得粗品 MBP(约75mg)。

用鲍金氏培养基35℃温箱培养百日咳杆菌，5d后收集菌落，菌液58℃水浴40min灭活细菌，用比浊管比浊法测得百日咳杆菌浓度为60×10的12次方/L。MBP粗提品溶于3ml生理盐水中与3ml完全福氏佐剂(卡介苗含量33mg)混合成油包水乳剂，大鼠于双后足垫皮内分别注射0.3ml油包水乳剂和0.1ml百日咳杆菌。注射当天定为0d，每日称重并观察动物的神经症状。EAE的严重程度依据Knono等的标准评定。根据实验进程需要分别取不同病变时期的实验的鼠脑和脊髓组织，用10％的甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。

(2)模型特点  实验组大鼠注射抗原后精神萎靡、食欲减退、体重逐渐下降。部分动物自第8日开始出现EAE明显症状：尾部张力下降，继而尾部张力消失。继尾部张力消失后出现单侧后肢及双侧后肢无力，继而单侧及双侧后肢瘫痪，人为翻身后不能恢复姿态，严重者四肢瘫痪，个别动物因病情严重而死亡。动物发病的高峰期为注射抗原后10～15d，表现为一次性急性发病过程，严重者四肢瘫痪、死亡。组织学检查光镜下可见，EAE大鼠的脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润，炎性细胞聚集在血管周围呈现袖套样改变。存活者症状可逐渐缓解，体重逐渐恢复，约在注射抗原30d后可完全恢复。

(3)比较医学  作为MS的动物模型，EAE为MS发病机制的研究提供了便利条件。采用本法实验组动物的发病率达100％，有些动物模型因病情严重而死亡。此模型发病率高且病情严重的原因可能有以下两方面：一是抗原MBP用量大(3mg/只)。MBP为诱发EAE的主要抗原物质，研究表明，MBP可激活体内Th1+细胞，使之穿过血脑屏障，攻击自身神经髓鞘的MBP，从而导致神经细胞脱髓鞘，引起 EAE或MS；二是采用新培养的百日咳杆菌效果好于成品的百日咳疫苗。百日咳杆菌的毒素可增加血管的通透性，使致敏的T细胞易于通过血脑屏障攻击神经髓鞘。该模型利用易获得的牛脊髓MBP的粗提品，诱导的大鼠EAE模型，发病率高，病情典型，为MS的研究提供了一个良好的模型。