动脉粥样硬化的病理变化包括脂质条纹、纤维斑块、粥样斑块、复合病变等，而泡沫细胞(foam cell)是As病变的早期细胞学特征。泡沫细胞由单核/巨噬细胞和从动脉中膜迁移到内膜的平滑肌细胞(SMC)摄取大量脂质而成。利用巨噬细胞或SMC复制泡沫细胞模型，是动脉粥样硬化实验研究中常用的重要方法。

巨噬细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表面存在清道夫受体(scavenger receptor)，能大量地摄取修饰变性的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,  LDL)，特别是氧化LDL(oxidized LDL, OX-LDL)，使细胞内大量充盈脂质，在电镜或光镜下呈泡沫状，故称泡沫细胞。经油红O染色后呈红色颗粒状，含大量胆固醇，且胆固醇酯约占其50％。因而通过先制备OX-LDL，再使其作用于巨噬细胞或血管平滑肌细胞，即可造成泡沫细胞模型。

一、ox-LDL的制备和鉴定

(一)LDL的制备

    1．取新鲜血浆100～200ml，加入PDB(含0.9％NaCl，0.01％NaN3，10mmol/L Tris-HC1及1mmol/L EDTA，pH7.4的缓冲液)以防腐和防氧化。

    2．超速离心18小时，8℃，42 000r/min。

    3．吸出漂浮于离心管上层的乳白色液体(VLDL)及次层淡黄色液体(IDL)。

    4．收集离心管下层液体，加入固体KBr使最终密度为1.063g/ml。

    5．再次超速离心20小时，8℃，42 000r/min。

    6．吸出上层橙黄色的液体即LDL。

    7．提纯的LDL在含200μmol/L EDTA的PBS液中透析48小时，过滤除菌，4℃保存。

    8．制备OX-LDL最好使用新鲜血浆，所用试剂均应在AR级以上，超速离心上样和取样时均应细心操作，尽量减少机械扰动。

    9．血清密度调节公式Vn=Vo(dm－do)/(dn－dm)式中Vn为需加入的高密度液体积(ml)， dn为需加入的高密度液密度(g/ml)，do为密度调节前血清的密度(g/ml)，Vo为密度调节前血清的体积(ml)，dm为需调节的密度(g/ml)。

(二)LDL的氧化修饰和鉴定

    1．在氧化前，LDL先用无EDTA的PES液透析24小时，以除去EDTA。

    2．将LDL在37℃含10μmol/L CuSO4的PBS液中氧化12小时；然后在4℃含100mmol/L EDTA的PBS液中透析，每8小时换液一次，透析24小时，过滤除菌，4℃保存。

    3．用硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)的含量鉴定ox-LDL。即将样品或丙二醛标准品0.1ml加于2.9ml复合液(含CCICOOH 0.92mol/L，C4H4N2O2S 0.026mol/L，HCl 0.25mol/L)中，于100℃水浴放置30分钟，冷却后测定其在532nm的OD值，计算TBARS含量。再以总胆固醇试剂盒测LDL-C含量。ox-LDL的氧化修饰程度以每克胆固醇的TBARS含量表示。

一、细胞培养

复制泡沫细胞模型的细胞一般采用巨噬细胞或血管壁平滑肌细胞。也可用人脐静脉内皮细胞(ECV304)、人单核细胞(U937)、中国仓鼠卵巢细胞、鼠腹腔巨噬细胞等。

(一)巨噬细胞的收集和培养  小鼠腹腔巨噬细胞最为常用。取8周龄、无感染的小鼠，眼球放血或颈椎脱位致死，用70％酒精消毒腹部皮肤。在无菌条件下，用镊子提起腹部剪去3～5cm长的皮肤，暴露去皮的腹部，再用注射器将3～4ml无血清的1640培养液注入腹腔；轻揉片刻后抽出腹腔液，并注入离心管中，于4℃，1000r/min离心10分钟。去上清液，加同样培养液调整细胞数为(1～5)×1000000/ml。若需要的细胞数多，可将数只小鼠的细胞收集在一起。而豚鼠家兔腹腔巨噬细胞的取得，需在数日前于腹腔注射液状石蜡诱发巨噬细胞在腹腔聚集。

培养方法：由于巨噬细胞有很强黏附力，最常用贴壁法分离。将含有巨噬细胞的悬液加到盖玻片、培养瓶或培养板内，于37℃培养30～60分钟。巨噬细胞开始贴壁时用Hanks液冲洗5次，以洗去未贴壁的其他细胞，以获得较纯的巨噬细胞。之后用含10％小牛血清的1640培养液，置37℃培养箱孵育。巨噬细胞是终末细胞，不能长期传代培养。

(二)VSMC的获取和培养  常用猪、大鼠、小鼠等动物的动脉获取VSMC。

1．原代培养  无菌状态下取胸主动脉，用含青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)的 D-Hank平衡盐溶液将动脉洗涤数次，洗掉取材时粘在组织上的血块和破损细胞。剪去外膜脂肪，纵行剖开血管，细心刮去内膜，用培养液清洗一遍后，将留下的中膜剪碎成1mm3左右的组织块。之后，选用酶消化法或组织块种植法进行原代培养。

培养液的配制：

(1)RPMI-1640：将一袋RPMI 1640干粉倾入500ml三蒸水中，充分混合，使之完全溶解；加入2.1g NaHCO3、5.95g HEPES，110mg丙酮酸钠及青、链霉素各10万U，补三蒸水至1000ml，充分混匀(置4℃下，4～6h)，用预先消毒好的Zeiss滤器过滤除菌，分装入无菌瓶中，4℃保存。

(2)0.125％胰酶：称取胰蛋白酶125mg，加入D-Hanks液100ml中，混匀，置4℃4～6小时后，经0.22μm的滤膜过滤除菌，分装冻存于-20℃。

细胞计数及细胞活力测定：

(1)细胞计数：将稀释后的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙，勿留气泡，稍候片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数；压线者只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：

(大格中的细胞数/4)×10000×稀释倍数=细胞数/ml

(2)细胞活力测定：试剂配制：①4％胎盘蓝母液：称取4g胎盘蓝，加少量双蒸水研磨后，调节pH至7.0～7.20。加双蒸水至100ml，离心后取上清。②1.8％氯化钠溶液。

操作步骤：用前两液以1：1混合，制成2％胎盘蓝液。取1滴细胞悬液和1滴胎盘蓝液混合，取1滴染色细胞悬液，小心地置于白细胞计数板上。活细胞不着色，死细胞核呈蓝色。按白细胞计数法数四大方格内死细胞和活细胞数。用活细胞占计数细胞的百分比表示其活力。

活细胞％=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

1)酶消化法：将剪下的组织块置于0.1％的胶原酶中，在37℃放置1小时后倒掉消化液。再加入0.25％的胰蛋白酶进行消化。每消化10分钟，就将含有细胞的消化液吸去，换入新鲜的胰蛋白酶重新分散细胞。如此反复数次，收集所有含细胞的消化液。前两次含细胞的消化液常被弃去，后几次的含细胞的消化液被吸出后立即加入等量的D-Hank液，也可在含细胞的消化液中加入10％小牛血清。将收集的含细胞消化液离心沉淀(800～1000r/min，10分钟)。弃去上清液，收集细胞，加入2ml培养液，制成细胞悬液，计数后定量种入培养瓶。放置于37℃恒温培养箱1～2天后，细胞将自然贴壁。

2)组织块种植法：①取8周龄雄性大鼠，断头处死，3％碘酒及75％酒精消毒胸腹部皮肤；②开胸，暴露主动脉，夹住主动脉弓，向下分离主动脉周围结缔组织：③剪断主动脉，置于预先加有培养液的无菌培养皿中，将血凝块洗干净后，剥除外膜的纤维脂肪层：④用眼科剪沿血管外侧纵向剖开，内膜面向上，用刀片自上而下刮1～2次，以除去内皮细胞；⑤用镊子小心撕下近内膜面的中膜平滑基层，浸泡在含10％胎牛血清DMEM培养液内，用眼科剪将血管条剪成1～2mm的小块；⑥用吸管将小块吸出注入培养瓶中，在底壁上摆置均匀，小块间距离0.5cm为宜，轻轻翻转培养瓶，瓶底在上(注意勿使组织块流开)，加入培养液，37℃，95％空气－5％CO2培养2～4小时：⑦然后慢慢翻转培养瓶，令液体缓缓覆盖组织小块，注意勿使小块从瓶壁上冲掉，再继续培养。这过程动作要轻巧，让液体缓缓覆盖组织块，严禁动作过快液体产生冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。组织块培养也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入培养箱培养24小时再补加培养液。⑧约5天，可见平滑肌细胞从组织块中长出，待长满瓶底时可传代。

有报道用Ⅰ型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞，可明显缩短消化及培养时间，具备收获细胞多，细胞纯度高等优点。方法如下：①取材。将150～200g雄性SD大鼠脱颈使其死亡，颈动脉放血，迅速取出胸主动脉，浸泡入装有无菌Hanks的培养皿中，并转移到无菌操作台。②消化。分两次消化，首先将动脉用Hanks液漂洗2～3次，并剪去血管外脂肪及结缔组织，放入2g/L胶原酶。(1.5ml/动脉)消化液中消化20～30分钟。然后，用5号镊子夹住外膜，向相反方向柔和拉扯除掉外膜。将动脉置于含10％NCS的DMEM中孵育24小时。然后取出动脉，再放入含2g/L胶原酶。以及0.25g/L弹性蛋白酶的复合消化液中(1.5ml/动脉)，在5％CO2、37℃培养箱中孵育2小时左右。③培养。血管被完全溶解后，加入含20％NCS的DMEM终止消化，150g离心5分钟，弃上清液，用计数板计数细胞，以(1～3)×10000000/ml活细胞接种在含20％NCS的DMEM 25ml培养瓶中。放入5％CO2、37℃培养箱中培养。24小时后便可看到少量贴壁平滑肌细胞，2～3天后更换新鲜培养液。5天左右，细胞达到70％～80％融合时即可按常规方法传代。

2．传代培养  原代培养细胞生长融合后，用胰蛋白酶和机械分散方法消化分散细胞，将细胞计数定量移入新的培养瓶中，细胞仍可继续分裂，不断生长。通过传代，可以逐步剔除原始组织块中的其他细胞成分，从而获得较纯的细胞株。

(三)建立泡沫细胞模型  腹腔巨噬细胞或SMC传至3～5代，铺满瓶换培养液后，加入已制备好的ox-LDL，建立泡沫细胞模型。加入ox-LDL的量和孵育时间随着细胞的种类和ox-LDL的修饰程度不同而有所差异，可通过观察时量关系和量效关系来确定。已有资料报告：U937细胞与80mg/L ox-LDL孵育48小时可成功复制出U937泡沫细胞；用佛波醇酯(10的-7次方mol/L)诱导人单核细胞性THP-1细胞分化为巨噬细胞(72小时)，再以ox-LDL50mg/L刺激巨噬细胞，48小时可形成泡沫细胞；C57BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞加入10mg/L ox-LDL培养72小时可促成泡沫细胞：猪主动脉平滑肌细胞与15mg/L ox-LDL培养72小时可形成平滑肌细胞源泡沫细胞：也有人用大鼠主动脉平滑肌细胞与50mg/L ox-LDL培养72小时，也可形成平滑肌细胞源泡沫细胞。

建立的泡沫细胞要经过细胞形态显微观察和细胞内胆固醇的含量测定给予证实。

1．细胞形态学的观察  将贴有巨噬细胞或VSMC的盖玻片取出，用油红o方法染色。染色方法有多种，大同小异，这里介绍一种操作步骤少，用时短，染色简便有效的方法，可供首先选用。

    (1)PBS液冲洗3次，每次5分钟。

    (2)用50％异丙醇固定1分钟。

    (3)油红o工作液中染色10分钟。

    (4)用单蒸水冲洗3次，每次1分钟。

    (5)用苏木精染色5分钟。

    (6)流水轻轻冲洗30分钟。

    (7)干燥后用10％聚维酮封片。

    片子染色后在光学显微镜下观察，脂滴染成红色，胞核为蓝色。

    2．细胞内胆固醇(CH)和胆固醇酯(CHE)的测定

(1)酶法：用0.25％胰酶消化1分钟，收集细胞，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用PBS液冲洗一次，加入异丙醇0.5ml，在超声波清洗器上震动10s/min，共3次，再以1000r/min离心15分钟。吸取上清液用TC试剂药盒及FC试剂药盒分别测定其总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)，并将其离心沉淀物用0.1mol/L NaOH 0.5ml裂解细胞，用Lowry法测定细胞蛋白含量。细胞内的胆固醇含量以TC mg/g细胞蛋白和FC mg/g细胞蛋白表示，两者之差即为CHE mg/g细胞蛋白含量。

(2)高效液相色谱：细胞培养及处理：按前述方法培养细胞和建立泡沫细胞模型。①胆固醇标准配制。称1.5g标准胆固醇先溶解于少许乙醇中，逐渐升温到20℃，并把乙醇体积补满到150ml，标准胆固醇液的工作浓度分别为0.29(50)、0.258(100)、0.516(200)、1.032(400)、2.064(800)mmol/L(mg/L)，4℃下储存备用。②细胞内胆固醇及胆固醇酯的提取。将每10ml细胞收集入带盖的10ml的塑料管中，在1500r/min、4℃离心15分钟，去上清后，用1ml 0.9％NaCl溶液重新稀释细胞，冰浴中超声破碎细胞。工作条件为600周，工作时间为4秒，间歇时间为8秒，定时次数为6次。用Lowry法测定蛋白含量。在细胞溶解产物中加入等体积的新鲜配制的15％的醇溶性KOH(-20℃)，涡旋至细胞溶解产物清亮，加入6％的三氯乙酸去蛋白，再加入等体积的正己烷：异丙醇4：1溶液(V/V)，将混合物涡旋5分钟，然后在3500r/min、15℃下离心5分钟，收集上层有机相，将下层水相按上述方法重复抽提2次，将混合的有机相转移到一个带盖的试管，再在真空冷冻干燥机中65℃干燥，在室温中冷却后，加入100μl异丙醇：正庚烷：乙腈比例为35：12：52(V/V)的混合溶液，将样品溶解，用活性炭去色素，超声除气5分钟，在1500r/min离心5分钟后，收集上清液，取10μl进样，进行高效液相色谱分忻。③分析细胞内胆固醇。采用Waters991型色谱系统，其中包括510泵、U-6K进样器、991型光电二极管矩阵检测器、TCM色谱柱恒温盒，采用Waters公司生产的Gen-PAK FAX柱，以正庚烷：异丙醇：乙腈为流动相进行非梯度洗脱，流速1ml/min，柱温保持4℃(加冰块)，紫外检测时间12分钟，226nm检测。Gen-PAK FAX柱子在使用之前用去离子水冲洗10分钟(流速0.5ml/min)以除去柱中的醇类物质。④细胞内胆固醇及胆固醇酯定量。胆固醇的定量参考王佐等的方法进行，以峰面积定量，以mg/g细胞蛋白为单位。胆固醇酯的定量参考周新等的方法，以胆固醇酯酶水解，以HPLC测定总胆固醇量，以总胆固醇量减去游离胆固醇量代表胆固醇酯的量，以mg/g细胞蛋白为单位。

人类疾病动物模型都是依照研究目的而设计，不同的研究目的选用的动物模型可有很大差别。特别应该注意的是研究者要根据课题的研究目标和研究内容选择合适的动物模型。此外，由于动物与人类之间存在着很大的差异，即使复制的As动物模型相对真实地、客观地反映人类As发病学的某一个或某几个方面，但动物疾病模型并不能与人类疾病完全相同。所以，在分析实验结果、尤其是用动物疾病模型研究药物效用时应充分考虑动物模型的局限性。