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实验方法

大鼠/小鼠计量化辨证的方法和标准

2017年01月20日 浏览量: 评论(0) 来源:《大鼠、小鼠辨证论治实验方法学》 作者:方肇勤 主编 责任编辑:yjcadmin
摘要:作为计量化辨证,以及辨证论治疗效评价和比较,计量辨证是十分重要的。而且,在大多情况下,症状与体征只是出现程度上的改变,而不是存在或消失,但这仍具有十分重要的临床意义。

作为计量化辨证,以及辨证论治疗效评价和比较,计量辨证是十分重要的。而且,在大多情况下,症状与体征只是出现程度上的改变,而不是存在或消失,但这仍具有十分重要的临床意义。

在获取计量化四诊信息后,大鼠/小鼠的计量辨证可以借助于Excel的数据存储和运算功能。方法如下:

1.部分化检测指标的计算

例如,按照前面介绍的方法[r=R/(R+G+B)],计算出反映爪、尾红色程度的r值(表3-3-15)。

2.求出各组各检测值均数和标准差

在正常对照组和模型组下面插入行,并统计出各检测值的均数和标准差(表3-3-16)。

进而采用Excel作图,可以直观地看到各体征在不同组别的整体表现,有一个大致的印象(该步骤可以省略):

    模型组小鼠体重显著减轻,消瘦,有阴虚证表现;模型组小鼠腋温显著降低,有阳虚证表现(图3-3-1、图3-3-2)。

模型组小鼠旷场自主活动显著减少,懒动、乏力,有气虚证表现;模型组小鼠爪尾红色程度显著降低,爪尾色淡,有血虚和阳虚证表现(图3-3-3、图3-3-4)。

总之。模型组小鼠总体上存在气血阴阳俱虚的表现。

3.求出气血阴阳盛衰程度

(1)气盛衰度

气盛衰度=(各动物抓力/正常组均数)×0.5+(各动物水平/正常组均数)×0.3+(各动物直立/正常组均数)×0.2

说明:

1)指标入选的依据。在以往药理学实验中已建立起多种大鼠/小鼠行为学检测方法,例如悬尾不动、抖笼、旷场、抓力,还有跑台、跑笼、烟囱攀爬、游泳等。但是,其中部分实验检测周期长,比如游泳,而且还会造成严重的心理影响,不适用于大批量的动物实验。因此,我们先后观察了悬尾不动、抖笼、旷场和抓力。研究发现:

①悬尾不动。该方法最早用于检测小鼠的失望与放弃。检测中,小鼠易于疲劳,造成耐受;而且对于肿瘤小鼠,随着肿瘤体积增加,会干扰其自然的扭体反应。

②抖笼。该方法检测单位时间内小鼠自主活动引起的振幅和频率。但检测耗时长,虽然一些设备能同步检测4~6只小鼠,但对于大批量动物实验仍不合适;且小鼠也会发生显著的耐受。

③旷场。该方法检测单位时间内小鼠自主探究和活动,主要观察水平移动距离和前肢离地站立次数等两项指标,其原理近似抖笼。经我们改造后,可以同步检测批量小鼠,大大提高了检测效率。方法采用不同组别鼠同步检测,用数码摄像35s,检测后计算机反复播放,逐一计数。从而保证了不同组别、不同小鼠检测时间、条件一致,具有可比性;一旦判读失误,还可以重新播放录像,再次计数;并且可以加快计算机播放速度,提高计数效率;而且还具有一个人独立操作等优点,使准确性和检测效率大为提高。

④抓力。当手持大鼠/小鼠尾根部将其拖离抓力仪时,大鼠/小鼠会尽力握住设备,直至被拉脱。该方法可以检测到其最大抓力值,反映其气力。

通过长期实践,我们最后确定把旷场和抓力作为四诊检测的计量化指标,用以模拟人类的乏力、懒动、精力、肌力,准确地反映气的盛衰程度。由于动物兴奋状态,以及对检测的耐受、适应、疲劳不同,会导致检测出现偏差;而连续多次的重复检测(如一些方法所建议的),会增加动物的耐受,检测值会不断下降。鉴此,我们综合抓力与旷场的检测,以弥补单独采用所带来的偏差,最大限度地准确刻画气盛衰的真实程度。

此外,大鼠/小鼠的饮水量、摄食量、心率等也能在一定程度上反映气虚程度,可以较小权重引入。

2)采用与同次检测正常对照组均数的比值,可以有效地纠正批次检测所带来的误差,且可以方便地与前次或以后检测值比较。下同。

3)权重设立的依据。依据长期的观察,我们发现,抓力检测稳定而可靠,重复性最好,因此权重宜大,定为0.5;旷场水平移动较直立次数稳定,所以前者权重定为0.3,而垂直站立数检测重复性较差,权重定为0.2。以此作为小鼠“气盛衰度”权重的依据。

4)大鼠/小鼠的差异。我们发现,大鼠旷场自主探究性活动不活跃,体重较大的中年大鼠活动更少,因此,对于大鼠而言,旷场检测值权重宜下调,建议调整为:抓力×0.7+水平×0.2+直立×0.1。

5)若未检测抓力,气盛衰度=(各动物水平/正常组均数×0.6)+(各动物直立/正常组均数×0.4)。以上小鼠的计算结果见表3-3-17。

 

 

(2)血盛衰度

血盛衰度=(各动物爪r值/正常组均数)×0.7+(各动物尾r值/正常组均数)×0.3

说明:

1)血虚的定义。中医所谓的血虚主要包括两个方面:①类似于西医的贫血,如失血、造血障碍、营养不良等引起的贫血,出现面色少华、舌淡,主要表现在望诊有关红色程度的改变。但贫血往往伴随气虚,辨证多作气血两虚。②特殊的脏腑血虚,主要是心血虚、肝血虚,其中又以心血虚为多见,主要表现在心神失养,出现心悸、少寐等,以及筋脉爪甲和皮肤失养。此时,可以没有贫血,甚至望诊的颜色淡,如面色淡、唇色淡、舌色淡等不是主要的辨证依据,这给实验动物的辨证带来困难,是特殊情况。而且,习惯上一些疾病出现的轻度贫血,如肿瘤等慢性消耗性疾病,中医往往却不辨证为血虚,而是辨证为气虚、阳虚。

2)指标选择依据。依据贫血特征,血虚的主要指标应选自反映红色程度的舌 r值、爪r值、尾r值。然而,舌的检测要求麻醉动物,且麻醉后易干扰气血运行,因而难以作为常规检测。至于气虚,有专门评价标准;而心神和肝脉失养,在大鼠/小鼠中观察的较少,缺少经验,暂不列入血盛衰度的判断。因此,常规辨证采纳爪r值、尾r值。

鉴于阳虚也会出现面色少华、舌淡,所以血虚辨证标准的建立,还要求与阳虚鉴别,请予以注意。

3)权重设立的依据。我们曾证明,在反映红色程度等望诊信息方面,舌象最灵敏。爪次之且信息量大、灵敏,因此爪的权重定为0.7,尾较弱,不够灵敏,定为0.3。

4)一旦采集舌象,其权重应最大,权重建议调整为:

(舌r值/正常组均数)×0.5+(爪r值/正常组均数)×0.3(~0.4)+(尾r值/正常组均数)×0.2(~0.1)

5)一些特例。例如:C57小鼠尾部色素沉着,而C57大鼠尾部角化质厚,影响了其反映红色程度的灵敏性。为此其权重建议调整为:爪0.8~0.9,尾0.1~0.2。另外,尾的显微拍照于上部,当笼内垫料潮湿,如糖尿病多尿,导致爪、尾接触垫料面溃烂、颜色改变时,尾的上部反而不易受到影响,相对更真实些,其r的权重可适当提高。

(3)阴盛衰度

阴盛衰度=各动物体重/正常组均数

说明:

1)指标选择依据。阴虚主要表现为形质的减少,如消瘦、脉细、舌体瘦小、苔剥等。热象的出现提示火旺,而当与气虚、阳虚兼见时,阴虚证的热象往往不显著;至于阴不收敛导致的盗汗、失眠等,在所有阴虚证候中并不普遍,有其特殊性。因此,从检测方便计,主要采用了体重(或去瘤体重)作为阴虚评价指标。在大多情况下,该指标是客观的,可以初步满足阴虚的定量化检测。但是一旦实验动物具有肿瘤、水肿、消化道食物异常残留,则不可靠。而且,作为阴虚判断,该指标还不够灵敏,因此,建议在条件许可的情况下,增加一些指标。

2)f值。f值是爪中趾宽与掌面右侧上下两肉垫的比值,可以反映趾胖瘦的程度。通常阴虚患者手指(趾)消瘦,因此,该指标可以作为阴虚判断的因素之一。但是测量和计算耗时多,大样本实验开展困难。

3)Lee's指数。Lee's指数反映体重与体长的比例关系,能比较准确地反映大鼠/小鼠的胖瘦程度。对于那些可能导致体长不一致的实验动物,该指标正确性的优势更明显。但是,测量大鼠/小鼠体长,耗时较多,在大样本的动物实验中普及困难。

此外,大鼠/小鼠望诊涉及形质的减少的内容非常多,例如全身望诊和爪望诊:

4)爪望诊。在提取爪RGB之际,可以记录爪的胖瘦、厚薄。肉眼观察十分准确、灵敏,但是计量化困难。

5)全身望诊。与爪的望诊类似。

如何将这些指标引入阴虚计量化诊断,是今后的方向,有待探索。

(4)阳盛衰度

阳盛衰度=(各动物腋温/正常组均数)×0.3+(各动物爪r值/正常组均数)×0.5+(各动物尾r值/正常组均数)×0.2

说明:

1)阳的定义。中医学所指的阳虚、阳盛大体包括3部分内容:①热的程度(表现为体温、体表温度的高低,怕热或怕寒等)。②红、深色的程度(表现为面赤、舌红、肌肤红、尿赤等,或相反,面苍白、舌淡紫为寒)。③气的盛衰,包括脉的至数(数为阳盛、迟为阳衰)等。中医师在大多情况下是综合运用这些信息辨证的,一旦以上某一、二部分阙如,有时也能作出辨证,但可靠性差一些,用药也有区别。

2)指标选择的依据。依据阳的定义,我们选用了腋温和爪r值、尾r值。没有选择心率,是因为在一些条件下,如晚期的肿瘤,非创伤性心率检测难以开展,且检测相对费时。鉴于难以常规地开展舌象检查,该检测既费时,且麻醉对机体气血运行会产生一定的影响,因此我们没有把舌象、心率列入阳虚辨证的常规指标中。

3)权重设立的依据。式中,爪r值较为稳定、灵敏、可靠,因此加大权重,定为0.5;体表温度检测不够灵敏、变化不大,而且在以非发热为主要证候的疾病中,体温的变化不是临床辨证的重点,因此权重定为0.3;尾r值最弱,不够灵敏,权重定为0.2。不同品系的动物、不同造模和疾病动物,以及不同的病证,体温与面、舌、爪、尾的红色程度,辨证意义可能不同,值得深入比较研究,并依据实际,调整各指标的权重。例如,当以发热为主要证候者,腋温检测值的权重可以加大,甚至单列。

4)红外成像数据。红外成像可以比较全面地反映体内(眼部)和体表(躯体或爪、尾等)相对温度(距离愈远,所测温度会愈低),具有丰富的辨证意义。如何引入、取什么部位温度、各占比值多少,如何标准化数据处理,在不同疾病或证候的大鼠/小鼠中如何选择,有待摸索。

5)此外,同气虚检测一样,饮水量、摄食量也能在一定程度上反映阳虚程度,可以较小权重引入。

(5)肿瘤邪毒盛衰度

肿瘤邪毒盛衰度=各动物瘤重/所有动物均数

说明:肿瘤的病机为痰热瘀毒搏结。其邪毒壅盛者,肿瘤增长迅速;邪毒偏弱者,肿瘤增长迟缓。同一批次接种肿瘤的大鼠/小鼠,那些肿瘤增长快、体积大者,瘤重显著大于平均水平,可以辨证为“邪毒壅盛”。因此,邪毒壅盛与否是一个相对性的辨证指标,不是肿瘤大小的绝对值。我们以往的研究表明,一旦荷瘤小鼠出现邪毒壅盛证者,尤其是早期,其预后差;而那些早期肿瘤增长缓慢者,瘤重显著小于平均值,邪毒弱,预后好,具有统计意义;以后我们还发现,中医药辨证论治对于早期邪毒壅盛证的疗效相对比较突出。

(6)糖尿病胃热程度

糖尿病胃热程度=(各动物饮水量/正常组均数)×0.5+(各动物摄食量/正常组均数)×0.5

说明:

1)多饮多食、消谷善饥,是糖尿病肺胃燥热型消渴的典型症状,而且与糖尿病的严重程度相关。因此,该指标可作为糖尿病的诊断和疗效评价指标之一。

2)各指标权重确定的依据。糖尿病饮水量、摄食量增加具有相似的辨证价值,所以权重平分。

4.常见计量化辨证的辨证标准与命名

(1)常见证候辨证标准与命名

1)气盛衰的辨证标准:与正常组比较,>1.25为气盛,<0.75为气虚,<0.5为气虚甚,<0.25为气亏。

说明:与其他指标不同,大鼠/小鼠气的盛衰程度波动大,因此与正常组比较,气盛、气虚、气虚甚、气亏等差距较大。

2)阳盛衰的辨证标准:与正常组比较,>1.02为阳气盛,<0.98为阳虚,<0.95为阳虚重,<0.9为阳损。

说明:大鼠/小鼠阳热波动不大,因此与正常组比较,阳气盛、阳虚、阳虚重、阳损等阈值较为接近。

3)阴盛衰的辨证标准:与正常组比较,>1.2为形丰,<0.9为阴偏虚,<0.85为阴虚,<0.7为阴亏,<0.6为液脱。

说明:大鼠/小鼠体重变化较大,因此形丰、阴虚、阴亏、液脱的阈值差距较大。

4)血盛衰的辨证标准:与正常组比较,>1.1为血充盈,<0.95为血虚,<0.9为血虚重,<0.85为血亏。

说明:与阳盛衰近似。

5)肿瘤邪毒盛衰的辨证标准:>2为邪毒壅盛,>1.5为邪毒甚;<0.75为邪较弱;<0.5为邪弱。

说明:H22荷瘤小鼠的肿瘤体积个体差异大,因此,邪毒甚、邪毒壅盛、邪较弱、邪弱的阈值差距较大。

6)糖尿病胃热程度的辨证标准:与正常组比较,>2为胃热甚,>1.5为胃热。

说明:糖尿病大鼠饮水量、摄食量变化显著,因此将胃热、胃热甚的阈值差距定的较大。

依据此标准,以上小鼠的辨证阶段结果见表3-3-18。

(2)常见复合证候的命名

根据中医临床辨证习惯,依据以上阶段辨证结果,可以调整为复合证候命名。如编号为N5的辨证为“阳气盛体质”、编号为M7的辨证为“气虚阳损、精血虚”,具体见表3-3-19。

(3)大鼠/小鼠计量化辨证标准的一些问题

1)关于辨证标准的阈值。理论上讲,正态分布的数据,结合中医辨证的经验,可以依据大样本统计获得不同证候的阈值。例如,对大样本的全体正常实验动物进行检测,将各辨证值如“气盛衰度”按大小排序,结合其余四诊表现,取中间70%~90%数据视为正常范围,两端视为异常,如气盛或气虚;中间与两端间数值为气盛与气虚判断的阈值;再按该原则,向外划定气虚甚和气亏的阈值(正常动物可能阙如)。结合不同气虚的动物实验,可以进一步校正和完善不同气虚程度的阈值。

然而,鉴于大多数实验,所采用的动物样本量小,难以贴近大样本的数据特征,尤其是大鼠/小鼠批次不同、实验条件差异、月龄大小、性别不同等,会导致具体某一批动物的正常参考值发生较为明显的改变,数据的离散度、对相同刺激强度的反应发生变化。因此,期望得到一个适用于所有动物实验的标准阈值是困难而不可行的。

因此,辨证阈值应依据这样的原则,即在正式实验前,对所购入动物进行预检,依据预检结果,参考以往近似实验的结果,确定各证候辨证阈值。由于在同一批次内,动物证候具有相对的稳定性,因此该阈值对于该批动物内不同组别、不同时间检测的标准是一致的,因而是可以用于比较的。

2)辨证标准的相对性。与以上类似的,不同种属、品系的大鼠/小鼠,包括不同疾病的特殊性,辨证标准与命名应依据各实验的实测值及其离散程度进行调整,难以一成不变。因此辨证标准具有相对性,需要探索、优化和必要的调整。须注意的是,调整后所确立的标准适用于该批次动物不同组别、不同时间检测与辨证,保证一致。

3)关于辨证的正常参考值。正常参考值的意义在于:①作为辨证指标的基数,以后指标的改变,例如造模后证候的演变,以此参照。②作为大鼠/小鼠体质的筛选标准,在候选大鼠/小鼠中逐一明确不同大鼠/小鼠的体质,淘汰部分不合格的大鼠/小鼠。③作为检测随机分组后各组别划分合理与否的参考依据。

如前所述,鉴于不同种属、品系、不同性别、不同月龄、不同饲养背景的大鼠/小鼠,其生理具有特殊性,难以建立一成不变的正常参考值。因此,当购入大鼠/小鼠渡过服习阶段,正式实验前应进行全体检测,建立该批次大鼠/小鼠正常参考值。

以小鼠自然状态下心率为例,测得220只小鼠心率的平均值为697次/min,其数据符合正态分布或近似正态分布,按统计区间将其由慢到快,按照5%、10%、70%、10%、5%的数量划分为五档,中间的70%属正常范围,代表正常水平。紧邻两侧的10%属偏迟或偏数,最外两侧的5%为迟或数;若检测数据接近者,10%属偏缓或偏小数,两侧的5%为缓或小数(到不了偏迟、偏数、迟、数的程度);若检测数据十分集中,则两侧的15%甚至不能视为异常(范围可能缩小到10%,甚至5%以下)。这些要视具体情况决定。

4)关于不同批次检测误差的校正。在具体实验中,由于一些不确定和不明确的因素,会导致不同批次大鼠/小鼠四诊检测数据发生偏差。校正的方法是,视正常对照组均数为标准检测值,将所有个体(包括正常组个体)与正常对照组均数相比,取其比值(在1上下)进行组间和个体间的比较。这样可以有效地克服批次检测误差。因为,在同一批次内的检测,条件易于控制、一致。

5)四诊合参。包括两个方面:①计量化指标的四诊合参。②鉴于目前计量化指标尚不够丰富和实际大样本实验难以引入更多的计量化指标,因此,参考普通四诊指标十分必要。

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