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胚胎操作的环境控制
胚胎操作是指:胚胎从雌性动物的输卵管或子宫内取出后一系列体外处理的过程。在此过程中,对胚胎所能直接或间接接触的环境进行有效控制,是胚胎操作成功与否、或成功率高低的至关重要的条件。
( 一 ) 影响胚胎操作的环境因素
影响胚胎操作的环境因素主要有温度、空气洁净度、气相、pH 值、渗透压和无菌操作等。
1. 温度
动物胚胎生存和发育的最适温度是动物的体温,哺乳动物胚胎的最适温度为 37～38℃。温度不超过 39 ℃时,胚胎细胞代谢强度与温度成正比;高于此温度范围,细胞的正常代谢船 长将会受到影响,甚至于导致死亡。总的来说,细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强。把胚胎置于 25～35 ℃的较低温度时,仍能生存和发育,但速度放慢。由此可见,胚胎体外培养的温度应控制在相应动物的体温范围内,即 37～38 ℃;而胚胎操作工作室的温度宜控制在 25℃左右。工作室的温度过高对操作人员不利。
2. 空气洁净度
胚胎操作对空气洁净度的要求很高。空气中除了粉尘颗粒还有生物粒子,如细菌、病毒和立克次体等。工作室内空气中的粒子多,不仅极易造成胚胎的污染,而且对显微镜等光学仪器的使用寿命和使用效果也会造成不利的影响。笔者认为,胚胎操作工作室的空气洁净度应保 持在 10000 级(美国宇航局生物净化窒标准)以内,而要达到空气洁净度的标准,安装空气过滤系统是必要的。
3. 气相环境
氧是细胞代谢所必需的,氧参与呼吸代谢,为细胞的生命活动提供能量。不同的细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求不同。溶解氧浓度太低,细胞生长和代谢受到阻碍;溶解氧浓度太高会对细胞产生毒性,抑制细胞生长。高氧压对于胚胎细胞的发育会产生致死性的危害。
在细胞代谢中,C02是三羧循环的最终产物之一,这种产物一出现 , 就很快被培养基中的阳离子所固定,或与丙通酸结合生成草酸。这些反过来又可促进三羧循环。据此认为,C02有影响培养细胞的呼吸及延长细胞存活期的作用。它之所以能延长细胞存活期,主要原因在于它能调节细胞内的pH,是培养基中的重要的缓冲因子。
胚胎的培养应在 CO2培养箱内进行,设置 C02 的浓度为 5%更严格的控制气相,可在三气培养箱中进行,设置 CO2 的浓度为5%,02的浓度为 5%,N2的浓度为90%。
4.pH 值
合适的 pH 值是胚胎细胞生存和发育的必要条件之一。哺乳动物胚胎细胞的最适 pH值范围是7.2～7.4。为了维持胚胎细胞生存环境中 pH 值稳定,应该使培养基得到良好的缓冲常用的方法是在培养基中添加碳酸氢纳以及用 Hepes 来防止 pH 值的波动。
5. 渗透压
胚胎细胞的生存要求一定的渗透压,这在设计培养基时是很重要的。小鼠细胞的渗透压为 320mOsm/kg 左右。一般来说,哺乳动物胚胎细胞在 260～320mOsm/kg 范围内都可适应。培养基中的渗透压主要与氯化钠有关,其位电解质及葡萄糖对于维持渗透压也有一定的作用，而大分子物质对渗透压的影响就相对小的多。
6. 无菌操作
无菌的环境是胚胎操作的基础。在胚胎操作的各个环节,所使用的器皿、器材、培养基、实验材料等各种物品都必须保持严格的无菌状态,胚胎操作工作室也应尽量做到无菌。操作人员则必需建立极强的无菌意识和良好的无菌操作技能,这是实验能够成功进行所必需满足的基本要求。无菌环境是通过灭菌技术实现的。
( 二 ) 灭菌技术
所谓灭菌,是用物理和化学的方法,杀死物体上或空间内的一切微生物以及它们的芽孢或孢子。灭菌的方法有多种,要根据不同的灭菌对象采用不同的灭菌方法。
1. 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌即利用高温高压蒸汽进行灭菌的方法。由于热、湿及压力的作用 , 高压蒸汽灭菌可以杀死一切微生物,包括细菌的芽孢、真菌的孢子或休眠体等。高压蒸汽灭菌法适用于各种器皿、器械、培养基、蒸馆水、棉塞等的灭菌。高压蒸汽灭菌锅是实验室最常用的设备之一,然而由于操作细节的不注意,常导致达不到预期的灭茵效果。使用高压蒸汽灭菌锅时,应注意以下几点。
,(l) 灭菌锅内的冷空气必需排尽。冷空气的热膨胀系数大,若锅内留有冷空气,当灭菌锅密闭加热时,冷空气受热很快膨胀,使压力上升,造成灭菌锅内压力与温度不一致,产生假性蒸汽压,锅内实际温度低于蒸汽压表示的相应温度,致使灭菌不彻底。排出冷空气的方法有两种:缓慢排气和集中排气。缓慢排气法,即开始加热时便打开排气阀门,随温度上升,锅内的冷空气便逐渐排出,当锅内的温度上升到 100 ℃、大量蒸汽从排气阀中排出时,即可关闭排气阀,进行升压灭菌。集中排气法,即在开始加热灭菌时,先关闭排气阀,当压力升到 49KPa 时,打开排气阀 , 集中排出空气,让压力降到零,并有大量蒸汽排出时,再关闭排气阀进行升压灭菌。
(2) 灭菌锅内的物品必须排列疏松,使蒸汽畅通。灭菌材料若放的过多、过密,会妨碍蒸汽的流通,影响温度分部的均一,造成局部温度较低,甚至于形成温度"死角",达不到彻底灭菌而导致污染。
(3) 灭菌完毕,应缓慢减压。
(4) 灭菌时间应依容器的体积及培养基的多少有所增减。灭菌时间不可过长。否则培养基中的某些成分容易变性而失效。
2. 火焰灾菌
火焰灭菌是通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法。银子、接种针等耐热的工具可通过火焰的烧而彻底灭菌。
3. 干热灭菌
干热灭菌是利用加热的高温空气进行灭菌的方法。电热干燥箱是干热灭菌的常用设备。
干热灭菌适用于玻璃器皿和金属器械等物品的灭菌,但不适合用于含水分的培养基等材料。干热灭菌的温度一般要求在 160 ℃,维持 4Omin 至 2h 。
4. 紫外线杀菌
紫外线是一种最常见的对室内空间进行灭菌的方法,但如果配置或使用不当,则达不到预期的效果。紫外线是一种肉眼看不见的辐射线,可划分为三个波段:UV-A(长波段),波长 320～400nm;UV-B(中波段),波长280～320nm;UV-C(短波段),波长 100～280nm。强大的杀菌作用由短波段 UV-C 提供。由于 UV-C 具有较高的光子能量,当它照射微生物时 , 就能穿透微生物的细胞膜和细胞核,破坏其 DNA 的分子键,使其失去复制能力或失去活性而死亡。空气中的氧在紫外线的作用下可产生部分臭氧(03),当 03 的浓度达到0.01～0.05ppm 时也有一定的杀菌作用。紫外线可以杀灭各种微生物,包括细菌、真菌、病毒和立克次体等。
一般常用的灭菌消毒紫外灯是低压家气灯,在 C 波段的253.7nm 处有一条强线谱。用石英制成灯管,两端各有一对钨丝自燃氧化电极。电极上镀有钡和锶的碳酸盐,管内有少量的汞和氩气。紫外灯开燃时,电极放出电子,冲击汞气分子,从而放出大量波长 253.7nm 的紫外线。
紫外灯辐射强度和灭菌效果受多种因素的影响。常见的影响因素主要有 : 电压、温度、温度、距离、角度、空气含尘率、紫外灯的质量、照设时间和微生物数量等。
(1) 电压 : 国产紫外灯的标准电压为 220V,电压的不足,使紫外灯的辐射强度大大降低,当电压在 180V 时,紫外灯的辐射强度只有标准电压的一半。
(2) 温度 : 室温在 10～30℃之间,紫外灯辐射强度变化不大。室温低于 10 ℃,则辐射强度显著下降。
(3) 湿度 : 相对湿度不超过 50%,对紫外灯辐射强度的影响不大。随着室内相对湿度的增加,紫外灯辐射强度呈下降的趋势。当相对湿度达到 80%～90% 时,紫外灯辐射强度和杀菌效果降低 30%～40%。
(4) 距离 : 受照物与紫外灯的距离越远 , 辐射强度越低。3OW 石英紫外灯 ,100cm处比1Ocm 处的辐射强度下降了 14 倍。在室内,紫外灯适宜高度在离地面 2.5m 。
(5) 角度 : 紫外灯辐射强度与投射角也有很大的关系,直射光线的辐射强度远大于散射光线。
(6) 紫外灯的质量 : 紫外灯用久后即衰老,影响辐射强度。一般使用寿命为6000h左右使用一年后,紫外灯的辐射强度会下降 10%～20%。因此,紫外灯应及时更新。
(7) 空气含尘率 : 灰尘中的微生物比水滴中的微生物对紫外线的耐受力高。空气含尘率越高,紫外灯灭菌效果越差。空气每 cm3 中含有 800～900 微粒时,可降低灭菌率 20%～30%。
(8) 照设时间 : 每种微生物都有其特定的紫外线照射下的死亡剂量阀值 。 杀菌剂量（K）是辐射强度 (I) 和照射时间（t）的乘积 (K=It ) 。可见,照射时间越长,灭菌的效果越好。
上述可见 , 影响紫外灯消毒效果的因素是多方面的。无菌室应该根据各自不同的情况 , 因地制宜 , 合理配置、安装和使用紫外灯 , 才能达到灭菌消毒的效果。
例如 : 无菌室面积 15m2,高度为 2.5m,其空间为 37.5m3,则宜配置 4OW 紫外灯 1 支,或 2OW 紫外灯 2 支。而最好的是配置 2OW 紫外灯 2 支。如果整个房间只需安装 1 支紫外灯即可满足要求的功率,则紫外灯应吊装在房间的正中央。如果房间需配置 2 支紫外灯,则2支紫外灯最好互相垂直安装。紫外灯的照射时间应根据气温、空气湿度、环境的洁净情况等,决定照射时间的长短。一般的情况下,无菌室如按照 1W/m3 配置紫外灯,其照射的时间应不少于30min。如果配置紫外灯的功率大于 1W/m3, 则照射的时间可适当缩短,但不能低于 20min。
5. 过滤除菌
过滤除菌是通过机械性阻断微生物而达到无菌要求。常用的过滤除菌装置有正压式不锈钢滤器和蔡氏 (Zeiss) 滤器等。一些不能高温灭菌的溶液,如激素、酶液、血清等,可通过过滤装置除菌,根据不同的要求选用不同细度的滤膜。
6. 气体灭茵
用环氧乙烷气体灭菌锅主要用来对不耐高压蒸汽灭菌和平热灭菌的物品进行灭菌。使用环氧乙烷气体灭菌并可将吸附在被灭菌物上的气体排出。特别适合于对塑料培养皿等进行灭菌。
( 三 ) 胚胎操作室的设计
胚胎操作室的设计到目前为止,尚无统一的规范。根据笔者的体会,应包括缓冲间、准备间、洁净走廊和操作室等四个部分。
缓冲间是第一道屏障,操作者在这里更衣、换鞋,以及动物和物品的进入。可设计成十万级净化区。
准备间内需设置一超净工作台,配试剂以及其他准备工作。也可设计成十万级净化区。洁净走廊是第二道屏障,宜设计成万级净化区。
操作室是核心部位,在这里进行各种胚胎操作,设置显微操作仪、培养箱以及其他与胚胎操作相关的仪器设备。放置显微操作仪的工作台应用预制板做成固定的台面,以防止振动。操作室应设计成万级净化区。
湖北省农科院胚胎操作室的设计如图 5-8-1 所示,供参考。
( 四 ) 胚胎操作室的环境管理
1. 胚胎操作室的消毒灭菌
在进入实验的前 1h,打开胚胎操作室的紫外灯,照射 3Omin,关闭紫外灯。打开冈机30min 后,待臭氧基本散尽后,人员进入操作室开始王作。胚胎操作室的紫外灯开关应设在室外的走廊上。日常打扫卫生应每周打扫一次,用抹布擦拭地面。
2. 人员迸出的管理
(1) 人员进入外门厅脱去外衣,在外厅的鞋柜第一次换鞋;
(2) 通过实验室走廊进入胚胎操作室缓冲间,洗手并消毒后换消毒工作服并第二次换鞋;
(3) 进入准备间做各种准备工作;
(4) 通过清洁走廊进入胚胎操作室,用酒精棉球对操作台和有关的设施消毒,开始工作;
(5) 工作结束后,清理操作台,整理好各种仪器设备,擦拭地面,清理操作室房间;当天产生的垃圾当天处理干净;
(6) 离开操作室前注意关闭各种电器;
(7) 非胚胎操作人员禁止入内。
3. 动物进出的管理
进行各种胚胎操作实验应尽量使用 SPF 级实验动物。进行超数排卵等现场处理的工作,
应在层流柜中操作。进入胚胎操作室的动物,应首先在屏障动物室内,将动物置于 IVC 融 中,再带入胚胎操作室,进行取卵、移植等各种操作。操作结束后,再装入 IVC 鼠盒,送回屏障动物室。
