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大肠菌群检测
2015年09月29日
来源：原创
作者：李晓菲
责任编辑：admin
摘要：大肠菌群检测
1.目的
检测实验动物生活环境。主要包括饲料、垫料、饮水等卫生状况，判断微生物污染程度。
规范大肠菌群检验的基本原则、技术要求和方法
2.内容
2.1 设备和材料
2.1.1冰箱:0℃～4℃.
2.1.2恒温培养箱：36℃±1℃。
2.1.3恒温水浴锅：46℃±1℃。
2.1.4显微镜：10×～100×。
2.1.5均质器或灭菌乳钵。
2.1.6架盘药物天平：0g～500g，精确至0.5g。
2.1.7灭菌吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。
2.1.8灭菌锥形瓶：500ml。
2.1.9灭菌灭菌玻璃珠：直径约5mm。
2.1.10灭菌培养皿：直径90mm。
2.1.11灭菌试管：16mm×160mm。
2.1.12灭菌刀、剪子、镊子等。
2.2 培养基和试剂
2.2.1 乳糖胆盐发醇管
2.2.2伊红美蓝琼脂平板
2.2.3乳糖发酵管
2.2.4 EC肉汤
2.2.5 磷酸盐缓冲液
2.2.6革兰氏染色液
2.2.7沙黄复染液
2.3检样稀释
2.3.1 以无菌操作将固体样品25g或液体样品25ml置于含有225ml稀释液或灭菌生理盐水其他的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀样品稀释液。固体检样最好用均质器，以8000r～10000r/min的速度离心1min，做成1:10的均匀样品稀释液。
2.3.2用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml稀释液或灭菌生理盐水的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的样品稀释液。
2.3.3另取1ml灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1ml灭菌吸管。
2.3.4根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种三管。
2.4乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管,置36℃±1℃温箱内,培养24h±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
2.5分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36℃±1℃温箱内,培养18h～24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
2.6证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1个～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36℃±1℃培养臬内培养24h±2h,观察产气情况.凡乳糖管产气,革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
2.7报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。
2.8粪大肠菌群(Faecal coliform)
2.9用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内,置44.5℃±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24h±2h,经培养后,如所有EC
肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于
伊红美蓝琼脂平板上,置培养18h-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
2.10结果报告
根据证实有粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)粪大肠菌群的MPN值(见表1)。
|
阳 性 管 数 |
MPN |
95%可信限 |
阳 性 管 数 |
MPN |
95%可信限 |
||||||
|
0.10 |
0.01 |
0.001 |
|
|
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下限 |
上限 |
||
|
0 0 0 0 |
0 0 1 1 |
0 1 0 1 |
<3.0 3.0 3.0 6.1 |
-- 0.15 0.15 1.2 |
9.5 9.6 11 18 |
2 2 2 2 |
2 2 2 3 |
0 1 2 0 |
21 28 35 29 |
4.5 8.7 8.7 8.7 |
42 94 94 94 |
|
0 0 1 1 |
2 3 0 0 |
0 0 0 1 |
6.2 9.4 3.6 7.2 |
1.2 3.6 0.17 1.3 |
18 38 18 18 |
2 3 3 3 |
3 0 0 0 |
1 0 1 2 |
36 23 38 64 |
8.7 4.6 8.7 17 |
94 94 110 180 |
|
1 1 1 1 |
0 1 1 2 |
2 0 1 0 |
11 7.4 11 11 |
3.6 1.3 3.6 3.6 |
38 20 38 42 |
3 3 3 3 |
1 1 1 1 |
0 1 2 3 |
43 75 120 160 |
9 17 37 40 |
180 200 420 420 |
|
1 1 2 2 |
2 3 0 0 |
1 0 0 1 |
15 16 9.2 14 |
4.5 4.5 1.4 3.6 |
42 42 38 42 |
3 3 3 3 |
2 2 2 2 |
0 1 2 3 |
93 150 210 290 |
18 37 40 90 |
420 420 430 1,000 |
|
2 2 2 2 |
0 1 1 1 |
2 0 1 2 |
20 15 20 27 |
4.5 3.7 4.5 8.7 |
42 42 42 94 |
3 3 3 3 |
3 3 3 3 |
0 1 2 3 |
240 460 1100 >1100 |
42 90 180 420 |
1,000 2,000 4,100 -- |
|
注1：本表采用3个稀释度【0.1g(ml)、0.01g(ml)和0.001g(ml)】，每个稀释度接种3管。 注2：表内所列检验量如改用1g(ml)、0.1g(ml)和0.01g(ml)时，表内数字相应降低10倍；如改用0.01g(ml)、0.001g(ml)0.0001g(ml)时，则表内数字应相应提高10，其余类推。 |
|||||||||||
3.大肠菌群平板计数法
3.1 检验程序
3.2 检测方法
3.2.1 样品的稀释
3.2.2 平板计数
3.2.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1ml同时取1ml生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
3.2.2.2 及时将15ml~20ml冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3ml~4mlVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1培养18h～24h。
3.2.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
3.2.4 证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
3.2.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（ml）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(ml)=6.0×105CFU/g(ml)。
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