Martin Evans实验室首先成功地从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass)培养得到多潜能干细胞系，能在培养基中体外增殖，当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞(包括生殖细胞)的能力，这些细胞称为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)。ES细胞可以在体外长期培养，保持未分化状态，并可以对其基因组进行修饰和筛选；所得到的ES细胞克隆再注射入囊胚，ES细胞可整合入早期胚胎，参与胚胎发育，形成各种组织器官。如参与睾丸的发育，形成ES细胞来源的精子，可将遗传基因改变传入下一代，得到基因敲除或转基因动物。用ES细胞产生的第一个基因修饰动物为反转录病毒载体感染的转基因小鼠。ES细胞主要用于基因打靶，产生基因敲除小鼠。小于50kb的转基因通常不需要通过ES细胞法产生转基因动物；但是，对难以或没法进行显微注射的大基因(50～400kb)或超大基因(400kb～3Mb)，ES细胞途径显得尤为重要。例如，超大基因如TCR或Ig基因位点达到800～3000kb，可克隆入YAC载体，其转基因小鼠的制备通常需要借助ES和YAC细胞融合的途径来实现。

Es-酵母细胞融合法：这一技术是制备超大基因转基因动物的一个重要方法，已成功用于产生许多超大片段YAC DNA转基因小鼠，如免疫球蛋白和TCR基因位点转基因小鼠。这一方法不需要纯化YAC DNA。对DNA的大小没有明显的限制，500～2000kb的DNA都可以借融合的方法转入。酵母细胞膜外有坚硬的细胞壁，用酶消化细胞壁后，形成原生质球(spheroplast)，可与哺乳动物细胞(如小鼠ES细胞)通过PEG融合法，将YAC基因导入动物细胞内。酵母DNA和YAC DNA可同时转入小鼠ES细胞基因组，完整的YAC大DNA片段转入ES细胞基因组的效率相当高，带完整的YAC DNA的ES细胞克隆比例接近95％。YAC DNA转入的同时，酵母本身的染色体也部分或全部转入小鼠基因组；酵母基因组通常不在哺乳类动物细胞表达，也不影响ES细胞的多能性和小鼠的胚胎发育，转基因能够传入下一代。

最近，通过用转录因子Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc重新编程细胞，从胚胎的小鼠成纤维细胞中已能诱导生产多功能干细胞(induced pluripotent  stem cells,iPs)。通过一个被称为四倍体囊胚互补作用的程序，iPS细胞已经被用于生产活小鼠。尽管仍然处于自身的发展阶段，这一项技术很有可能提供一种强有力的方法，以实现从在体外被基因修饰的胚胎成纤维细胞中生产转基因动物。

ES细胞已被公认为是转基因动物、细胞核移植、基因治疗等研究领域的一种新试验材料，具有广泛的应用前景。然而，目前没能从牛、羊、猪和鸡等动物分离到ES细胞。目前利用ES细胞生产转基因动物受两个条件限制，它有可能被更好的方法取代。首先，目前只有小鼠的ES细胞可供商业应用，其他动物的ES细胞时有报道，如大鼠的ES细胞已建立成功，用于产生P53基因敲除大鼠。其次。即使有了ES细胞，由于中间还要经过繁殖嵌合体的阶段，对于小鼠来说问题不大，应用于生殖周期长、饲养费用高的其他家畜，会产生一定问题。当然，ES细胞是一种很好的核供体，很容易保存并在动物克隆中加以应用。