显微注射法是研发最早也是最成熟和应用最广的转基因技术，其他方法都是这一方法的改进和补充。借助显微操作系统将外源基因直接注入供体动物的受精卵中，使外源DNA整合入基因组中从而产生转基因动物。下面主要介绍受精卵原核显微注射法。DNA显微注射法的基本过程包括转基因载体的准备、胚胎操作和显微注射、转基因动物的鉴定和培育。

显微操作需要以下主要设备：倒置显微镜、显微操作系统、显微注射系统、体视镜、锻针仪和显微手术器械。倒置显微镜需要配置DIC功能，常用的品牌有Zeiss和尼康。微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope, DIC)的优点是能显示三维立体结构，便于直接将DNA注入细胞核内。显微操作系统主要包含：三维电动粗调微操作手、三维液压式微操作手、持针器、持针器夹持架、显微镜支架。主要品牌有eppendorf和 Narishige。eppendorf显微操作系统由TransferMan  NK2、CellTram vario(转运和注射用)、CellTram Air(固定受精卵用)或CellTram Oil(固定胚胎用)组成，显微注射仪使用FemtoJet/FemtotipⅡ，可将微量(约1～2pl)的DNA、RNA、蛋白质，注入受精卵的雄性细胞核内。

显微注射系统辅助设备有激光破膜系统或 Piezo机械打孔，适用于多种物种胚胎透明带的薄化，可显著提高ES细胞注射成功率。在体视镜下操作，获取和冲洗胚胎。

显微注射操作过程如图3-5所示，包括以下步骤：

图3-5  用显微注射技术制作转基因小鼠示意图

 1．转基因载体的准备  转基因载体构建好后，需要用限制性内切酶将载体消化，用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离转基因片段。用DNA胶回收试剂盒从胶上回收DNA片段，测定DNA浓度。注射用的DNA浓度通常很低，一般为2～3ng/μl。

2．胚胎操作和显微注射  DNA显微注射前需得到大量的注射用卵细胞，通常用激素(孕马血清 PMSG和人绒毛膜促性腺激素，hCG)刺激超排卵。按一定的时间点给4～6周龄的供体母鼠(FVB/DBA  F1或C57BL/6)注射激素(PMSG/hCG)。显微注射前一天将供体母鼠与公鼠交配，以便获得受精卵；另外还需准备胚胎受体鼠，DNA显微注射前一天，将C57BL/6母鼠与结扎的公鼠交配，第二天早上检查小鼠，有阴道栓的母鼠为假孕鼠。注射日，将超排母鼠解剖，剪下卵巢和输卵管，收集受精卵。用透明质酸酶消化清除周细胞，将卵细胞放于胚胎培养基液滴。调试显微操作仪和注射针，将DNA溶液移入显微注射针内。

显微注射的基本原理是在显微镜下用一个表面光滑的玻璃持针(holding pipette)吸住受精卵，用另外一个很细的玻璃针将DNA溶液直接注入受精卵的雄原核里。将注射过的受精卵移入受体动物的输卵管中，发育成子代动物。显微注射法的优点是简单快速、周期短，现在已成为经典的方法。

由于注射针很细，限制了注射的DNA的大小。转基因动物制备的难度，随着DNA片段的长度增加而增大。最常用的为质粒DNA，大小为10kb左右；大于50kb的DNA，比较难做显微注射；而400～500kb以上的DNA进行微注射难以成功得到完整的转基因。

BAC DNA显微注射：BAC为环状DNA，可以通过QIAGEN等DNA提取试剂盒分离。用适当的缓冲液重悬和保护BAC DNA样品，可增加BAC序列完整转入基因组的机会。用PFGE检测BAC DNA纯化后的分子完整性。通常使用显微注射的方法将BAC DNA直接注射入受精卵的细胞原核内。显微注射的BAC DNA有效浓度范围小，通常有效浓度为0.5ng/μl。如有必要，可降低浓度，增加受精卵存活率，提高出生率。由于BAC DNA较大，在注射时产生的剪切力有可能打断DNA，产生的转基因小鼠需要用PCR和Southern blotting等方法鉴定是否含有完整的BAC转基因。

注射的DNA通常成串地整合入一个单一位点，拷贝数从数个到上百个不等。由于多拷贝DNA的插入，可用于筛选高表达的外源基因转基因动物。普通转基因动物使用质粒作为载体，缺点是质粒DNA克隆的容量太小，不能克隆大的基因和表达调控元件，如位点控制元件。由于这些转基因动物在整合位点对应的同源染色体上没有相对应的等位基因，应该称它们为“半合子”而非“杂合子”。转基因整合数即转基因拷贝的数目通常和DNA片段大小呈反比。因此，越大的DNA片段越难整合成功。

由于原核注射的转基因整合是随机的，转基因的表达常常受插人部位周边基因的影响。由于整合的位点不同，每个转基因动物的转基因表达水平都不一样。这些效应可能会导致基因沉默，改变转基因的细胞和组织特异性表达或影响整个表达水平。当转基因整合入常染色质区域时，受周边内源性增强子的作用，转基因的表达会比较强；当转基因整合入异染色质区时，会产异染色质介导的沉默，降低表达水平。研究表明，整合位点可以很微妙地影响转基因在大脑中的表达。如果转基因插入内源性基因位点，可改变整合位点的内源性基因的表达，或者导致插入灭活。在实际操作中，可以通过分析多个始建鼠推断插入位点效应。插入位点效应也可以通过在转基因片段中加入绝缘子序列而减小。