小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤。下面以小鼠为例，介绍哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程。

实验技术

一、人工催情和超数排卵

1. 小鼠的性别鉴定：

成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。

2. 人工催情：

成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。每头雌鼠注射PMSG 5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现（图16.3）。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。在合笼后每天上午8-9 时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。

二、受精卵及囊胚的获得

1. 受精卵的获得：

将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。在腹部中央横剪一小口（0.5cm宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出（图16.4，16.5），置于盛有培养液的表面皿中。在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（图16.6）。如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管口轻轻夹住；左手轻推注射器，压出0.5ml冲卵液即可将输卵管中的卵冲出。一般在一侧输卵管中可冲出4-10个卵。收集到的受精卵带有卵丘细胞，必须在含有透明质酸酶（Hyaluronidase,1mg/ml）的培养液中溶去卵丘细胞，再将受精卵换到新鲜的培养液内洗涤3-4次才可用于移植。冲卵液要保持37℃。

2. 囊胚的获得：

取妊娠第四天的供胚鼠，同法取出子宫，放在消毒滤纸上，吸净子宫周围的血液。用装有冲卵液的注射器针头从上端（即靠近卵巢一端）插入子宫，将胚胎冲入培养皿中。用移卵吸管吸取胚胎放入新的培养液中清洗一下，用于移植。

三、假孕鼠的制作

1. 不育雄鼠：

选性成熟且健壮的雄鼠，结扎输精管，恢复2-3周后，与性成熟的雌鼠交配，检查雌鼠有阴道栓但不怀孕产仔。证明结扎手术成功，可作为不育雄鼠或称阉割鼠。

2. 供胚鼠：

选择性成熟且处于发情期的雌鼠，在下午4时左右与雄鼠合笼，第二天早晨挑出有阴道栓者为供胚鼠或称孕鼠。

3. 假孕鼠：

假孕鼠是胚胎移植时的受体。其生殖系统生理状态与移入卵的发育阶段同步，从而为移植的胚胎提供着床和继续发育的条件。一般选择生过一胎，母性较好的雌鼠和阉割鼠合笼，次日上午挑选有阴道栓者为假孕鼠。

四、胚胎移植

从受精卵到囊胚（受精0.5-3.5天），都可以转移至假孕鼠的生殖管道以完成发育。胚胎移植有输卵管移植和子宫移植两种。单细胞到桑椹期的卵可转移至受孕0.5天的假孕鼠的输卵管。输卵管移植仅适用于被透明带包裹的卵；3.5天的囊胚转移至假孕鼠的子宫。用于子宫移植的胚胎不需有透明带。

1. 输卵管移植（图16.7）：

（1）将假孕鼠麻醉后在背部偏下方表皮，70%酒精消毒。

（2）在背腰中央纵向剪开皮肤，开口约为0.7cm。用镊子沿切口剥开皮肤、肌肉，透过肌层可见白色脂肪垫位于脊柱两侧约1cm处。

（3）在脂肪垫的位置剪开肌肉层，切开0.5cm的小口，用小镊子夹住脂肪组织，把一侧的卵巢、输卵管与子宫一起拉出，固定好，置于显微镜下。

（4）用移胚管吸取卵子。可先吸入部分石蜡油，再吸卵以便于控制。吸卵前先吸1个气泡，然后再吸一段培养液，接着吸卵，再吸一个气泡，最后吸进一些培养液。

（5）用镊子夹住输卵管喇叭口周围接合部，随即将移胚管插入喇叭口中，轻轻向输卵管内吹气，直至第二、第三个气泡进入输卵管内。移胚管略停一下再行拔出，以防气泡与卵子逸出。

（6）将脂肪垫、卵巢、输卵管及子宫等复位，缝合伤口。小鼠苏醒后单笼饲养，18天左右分娩。

2. 子宫移植（图16.8）：

（1）小鼠的麻醉和解剖同输卵管移植。

（2）解剖镜下用小镊子夹住子宫上端，在子宫上端血管分布少处，用4号针头刺破子宫壁。拔出针头。

（3）用移胚管吸取囊胚，方法同输卵管移植，将移胚管沿原针刺孔隙插入子宫，轻轻将胚胎吹入子宫内。

（4）将子宫、输卵管及卵巢等复位。缝合伤口，消毒后等待小鼠苏醒。18天左右分娩。

实验观察

小鼠着床前的胚胎，直径约为90-100微米（包括透明带）。在解剖镜（25×）下，只能看到它的存在，对细胞形态无法辨认。在进行活体观察时，最好用150×或300×的相差显微镜，在视野内可以清楚地看到受精卵和周围的透明带，透明带内有1-2个极体，位于受精卵的一侧。哺乳动物的卵裂是不同步的，2细胞期分裂球近圆形，大小不完全相等，在两分裂球之间有一极体，透明带清晰可见。4细胞期与其他脊椎动物的分裂情况不同，可以看到四个分裂球交错排列。8细胞期，仍可看到极体和透明带。分裂球排列分成上下两层。分裂球均呈圆形。16细胞期为桑椹胚。32细胞期，在分裂球之间出现缝隙，系囊胚腔的开始。72小时后出现完整的囊胚腔，腔的一侧，集中有一群细胞，此即内细胞团。围绕囊胚腔四周的单层扁平细胞，称为滋胚层。此时的囊胚也称胚泡。晚期胚泡的透明带逐渐膨胀分解，在着床前去除透明带的胚泡呈椭圆形。

为了观察不同发育时期的胚胎，可以根据小鼠胚胎发育时间表（见附表），定时从孕鼠的输卵管或子宫内将胚胎取出进行观察（图16.9）。

小鼠胚胎发育阶段及所处部位

实验材料

1.实验材料：

性成熟雌、雄昆明小白鼠

2.实验仪器：

解剖镜、显微镜、相差显微镜、注射器（1ml）、4号针头（磨平、末端磨细）、玻璃探针、 微吸管（内径0.2mm）、表面皿、培养皿、双孔凹面玻片、外科手术器械。

3.实验药品：

孕马血清促性腺激素（PMSG）

绒毛膜促性腺激素（hCG）

冲卵液（杜氏磷酸缓冲液，pH7.2-7.4）：

NaCl 8.00g

KCl 0.20g

NaHPO4 1.15g

CaCl2 0.132g

KH2PO4 0.2g

MgCl2 0.1g

将上述药品称好后，放入试剂瓶内，再加重蒸水至1000ml，摇匀，用NaOH和HCl（0.1ml/1L）调pH到7.2-7.4即可使用，也可放入4℃冰箱中保存备用。

Whitten氏培养液：

NaCl 5.14g

KCl 0.356g

KH2PO4 0.162g

MgSO4.7H2O 0.294g

NaHCO3 1.9g

葡萄糖 1.0g

乳酸钠（60%） 3.7ml

乳酸钙 0.527g

丙酮酸钠 0.025g

青霉素 0.075g

链霉素 0.050g

1%酚红 1ml

小牛血清白蛋白3.0g

双蒸水 1000ml

麻醉剂（乙醚）、石蜡油、外科消毒药品、沙布、药棉等。