1 范围
本规范规定了果蝇伴性隐性致死试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化学品的遗传毒性检测。

2 规范性引用文件
OECD Guideline for Testing of Chemicals (No.477, April 1984)
USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines （Series 870.5275, June 1996）

3 试验目的
检测化学品能否引起果蝇生殖细胞的点突变和小的缺失突变。

4 定义
4.1 致死突变（Lethal Mutation）：是基因组的一种改变，当表达时引起携带者死亡。
4.2 隐性突变（Recessive Mutation）：是在纯合子或半合子试验生物中的基因组的一种改变，但只有纯合子才表达相应的表现型。
4.3 伴性基因（Sex-linked genes）：基因位于性染色体上，在本方法中指位于X染色体上的基因。

5 试验基本原理
根据隐性基因在性遗传中的交叉遗传特征，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上的隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变的存在。
据此，利用眼睛颜色性状由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突变的标记，故以染毒的野生型雄蝇（红色圆眼，正常蝇），与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼，在两个X染色体上各带一个倒位以防止F1代把处理过的父系X染色体和母系X染色体互换）交配，如雄蝇经受试样品处理后，在X染色体上的基因发生隐性致死，则可通过上述两点遗传规则于F2代的雄蝇中表现出来，并籍眼睛颜色为标记来判断试验的结果。即根据孟德尔分类可产生四种不同表型的F2代，有隐性致死时在F2代中没有红色圆眼的雄蝇。

6 试验方法
6.1试剂与仪器
6.1.1 试剂：乙醚、75%酒精、丙酸
6.1.2 培养基的制备
大小试管和海绵塞洗净后，分别于120℃ 2h干燥消毒后或晒干后备用。
6.1.2.1 蔗糖26g、琼脂3g，加水150ml
6.1.2.2 玉米粉 34g、酵母粉4g，加水150ml
6.1.2.3 步骤：按6.1.2.1煮沸后再按6.1.2.2倒入混匀、煮沸，然后加丙酸2ml，搅匀，分装于指管内，每管厚度约1.5～2.0cm，备用。
6.1.3 仪器和器材
电热恒热干燥箱、生化培养箱、立体解剖显微镜、放大镜、空调机、麻醉瓶、培养指管（3 cm×10 cm）、试管盘及架、白瓷板、海绵垫、毛笔、海绵塞。
6.2 实验动物：果蝇
雄蝇用3～4d龄的野生型黑腹果蝇（Drosophila melarogaster），雌蝇用Basc（Muller-5）品系3～5d龄的处女蝇。饲养环境温度控制在25℃±1℃。
6.3 受试样品配制
受试样品应溶于水中或悬浮于适当的赋形剂（如乙醇、吐温60或吐温80）中，然后在给样前用水或生理盐水稀释，避免用二甲基亚砜（DMSO）作为赋形剂。
6.4 剂量设计
对受试样品突变进行初步评价时，测试一个最大耐受剂量或者是可能达到的最高剂量，如果为了测定剂量-反应关系时，至少需要设三个剂量组。

6.5 染毒途径
可通过口服、注射或直接暴露于气体或蒸汽染毒。受试样品经口喂饲也可以放入1～5%的蔗糖溶液中，或必要时受试样品可溶于0.7%NaCl溶液。注射染毒可采用胸腔或腹腔注射。
6.6 对照 每次试验必须设置对照组
6.6.1阳性对照物：常用的阳性对照物有甲基磺酸乙酯(Methanesulfonate)和N-亚硝基二甲胺（N-Nitrosodimethylamine）。
6.6.2阴性对照物：所选溶剂。
6.7 试验步骤
6.7.1 处女蝇的收集
开始羽化后，清除管内所有成蝇，然后在8～10小时内收集的果蝇即为处女蝇。将处女蝇放入空指管中，每管不超过20只。
6.7.2 处理与交配
为检测受试样品对生殖细胞不同阶段敏感性，将雄蝇在接触受试样品以后分别相隔2~3天与新处女蝇交配，共3次（窝），分别代表对精子、精细胞、精母细胞的效应。每一指管以一只经处理过的雄蝇按上述程序与1～2只处女蝇交配，再以所产F1代按雄雌1:1或1:2进行F1～F2交配，12～14天后观察F2代，记录子代的致死数。试验的设计应具有预定的敏感性与测定的能力。每组的果蝇数量应符合试验设计的需要。通过阴性对照组观察自发突变频数，当试验组的突变率接近对照组突变率时，应重复试验进行验证。
6.7.3 试验结果评价
列表表明试验数据，包括被试验的染色体数、无生育力的雄性果蝇数，每一接触浓度、每一只被处理的雄果蝇和每一次交配期的致死染色体数。运用适合于试验设计的统计学检验。结果评价时应对试验结果将生物学意义和统计学意义同时予以考虑。试验组的观察结果比对照组明显增加，判为阳性，当应用多个剂量时，阳性致死呈现统计学剂量-效应关系时；或至少有一时间点的阳性致死可重复并有统计学意义上的增加，也应判为阳性。

7 鉴定报告
鉴定报告应包括以下内容：
7.1 果蝇：所有果蝇品系，昆虫年龄，处理的雄性数，不育的雄性数，已建立的F2培养群的数目，没有后代的F2培养群的数目，所测试的染色体数，在每一生殖细胞期检测的带有致死基因的染色体数。
7.2 试验条件：详细描述染毒和采样的时间表，剂量，毒性数据，阴性（溶剂）和阳性对照。
7.3 致死突变的标准
7.4 剂量-效应关系
7.5 统计学评价
7.6 结论

8 试验结果的解释：
果蝇伴性隐性致死试验阳性结果表明在该试验条件下受试样品引起果蝇生殖细胞突变；阴性结果表明在该试验条件下受试样品对果蝇生殖细胞属非致突变物。